什么是熒光顯微鏡?

　　熒光顯微鏡是以紫外線為光源， 用以照射被檢物體， 使之發(fā)出熒光， 然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的吸收、運(yùn)輸、化學(xué)物質(zhì)的分布及定位等。

　　細(xì)胞中有些物質(zhì)，如葉綠素等，受紫外線照射后可發(fā)熒光;另有一些物質(zhì)本身雖不能發(fā)熒光，但如果用熒光染料或熒光抗體染色后，經(jīng)紫外線照射亦可發(fā)熒光，熒光顯微鏡就是對(duì)這類物質(zhì)進(jìn)行定性和定量研究的工具之一。

　　熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區(qū)別：

　　1.照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射于樣品上;

　　2.光源為紫外光，波長(zhǎng)較短，分辨力高于普通顯微鏡;

　　3.有兩個(gè)特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光，目鏡和物鏡之間的用于濾除紫外線，用以保護(hù)人目。

　　熒光顯微鏡的應(yīng)用與注意

　　使用：

　　一、將材料片放在顯微鏡的載物臺(tái)上。

　　二、打開熒光顯微鏡穩(wěn)壓器，然后啟動(dòng)紫外燈，紫外燈15min內(nèi)不得關(guān)閉，關(guān)閉后3min內(nèi)不得再啟動(dòng)。

　　三、將激發(fā)濾光片轉(zhuǎn)至v，分色片調(diào)到v，選用495或475nm阻擋濾光片。

　　四、選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。

　　五、在玻片上加無熒光油，先用40 x，再用100 x調(diào)焦鏡檢.呈現(xiàn)熒光。

　　六、因熒光物質(zhì)受紫外光照射時(shí)隨時(shí)間的增長(zhǎng)熒光逐漸變?nèi)酰虼绥R檢時(shí)應(yīng)經(jīng)常變換視野。

　　七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時(shí)不加無熒光油)。

　　熒光圖像的記錄方法：

　　熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態(tài)學(xué)特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結(jié)果時(shí)，必須將二者結(jié)合起來綜合判斷。結(jié)果記錄根據(jù)主觀指標(biāo)，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術(shù)科學(xué)的發(fā)展，在不同程度上采用客觀指標(biāo)記錄判斷結(jié)果，如用細(xì)胞分光光度計(jì)，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結(jié)果，也必須結(jié)合主觀的判斷。

　　熒光顯微鏡攝影技術(shù)對(duì)于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時(shí)攝影記錄結(jié)果。方法與普通顯微攝影技術(shù)基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對(duì)熒光猝滅作用大，如FITC的標(biāo)記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動(dòng)或全自動(dòng)顯微攝影系統(tǒng)裝置。

　　注意事項(xiàng)：

　　(1)嚴(yán)格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進(jìn)行操作，不要隨意改變程序。

　　(2)應(yīng)在暗室中進(jìn)行檢查。進(jìn)入暗室后，接上電源，點(diǎn)燃超高壓汞燈5～15min，待光源發(fā)出強(qiáng)光穩(wěn)定后，眼睛完全適應(yīng)暗室，再開始觀察標(biāo)本。

　　(3)防止紫外線對(duì)眼睛的損害，在調(diào)整光源時(shí)應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡。

　　(4)檢查時(shí)間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發(fā)光強(qiáng)度逐漸下降，熒光減弱;標(biāo)本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，最多不得超過2～3h。

　　(5)熒光顯微鏡光源壽命有限，標(biāo)本應(yīng)集中檢查，以節(jié) 省時(shí)間，保護(hù)光源。天熱時(shí)，應(yīng)加電扇散熱降溫，新?lián)Q燈泡應(yīng)從開始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再用時(shí)，須待燈泡充分冷卻后才能點(diǎn)燃。一天中應(yīng)避免數(shù)次點(diǎn)燃光源。

　　(6)標(biāo)本染色后立即觀察，因時(shí)間久了熒光會(huì)逐漸減弱。若將標(biāo)本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時(shí)間，防止封裱劑蒸發(fā)。

　　(7)熒光亮度的判斷標(biāo)準(zhǔn)：一般分為四級(jí)，即“一”—無或可見微弱熒光。“+”—僅能見明確可見的熒光。“++”—可見有明亮。