1. cDNA產(chǎn)量的很低

　　可能的原因：

　　*RNA模板質(zhì)量低

　　*對(duì)mRNA濃度估計(jì)過高

　　*反應(yīng)體系中存在反轉(zhuǎn)錄酶抑制劑或反轉(zhuǎn)錄酶量不足

　　*同位素磷32過期

　　*反應(yīng)體積過大，不應(yīng)超過50μl

　　2. 擴(kuò)增產(chǎn)物在電泳分析時(shí)沒有條帶或條帶很淺

　　*最常見的原因在于您的反應(yīng)體系是PCR的反應(yīng)體系而不是RT-PCR的反應(yīng)體系

　　*與反應(yīng)起始時(shí)RNA的總量及純度有關(guān)

　　*建議在試驗(yàn)中加入對(duì)照RNA

　　*第一鏈的反應(yīng)產(chǎn)物在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，在總的反應(yīng)體系中的含量不要超過1/10

　　*建議用Oligo(dT)或隨機(jī)引物代替基因特異性引物(GSP)用于第一鏈合成。由于RNA模板存在二級(jí)結(jié)構(gòu)，如環(huán)狀結(jié)果，有可能導(dǎo)致GSP無(wú)法與模板退火;或SSⅡ反轉(zhuǎn)錄酶無(wú)法從此引物進(jìn)行有效延伸。

　　*目的mRNA中含有強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄中止位點(diǎn)，可以試用以下方法解決：

　　a. 將第一鏈的反應(yīng)溫度提高至50℃。

　　b. 使用隨機(jī)六聚體代替Oligo(dT)進(jìn)行第一鏈反應(yīng)。

　　3. 產(chǎn)生非特異性條帶

　　*用RT陰性對(duì)照檢測(cè)是否被基因組DNA污染。如果RT陰性對(duì)照的PCR結(jié)果也顯示同樣條帶，則需要用DNase I重新處理樣品。

　　*在PCR反應(yīng)中，非特異的起始擴(kuò)增將導(dǎo)致產(chǎn)生非特異性結(jié)果。在低于引物Tm 2至5℃的溫度下進(jìn)行退火，降低鎂離子或是目的DNA的量將減少非特異性結(jié)果的產(chǎn)生。

　　*由于mRNA剪切方式的不同，根據(jù)選擇引物的不同將導(dǎo)致產(chǎn)生不同的RT-PCR結(jié)果。

　　4. 產(chǎn)生彌散(smear)條帶

　　*在PCR反應(yīng)體系中第一鏈產(chǎn)物的含量過高

　　*減少引物的用量

　　*優(yōu)化PCR反應(yīng)條件/減少PCR的循環(huán)次數(shù)

　　*在用DNase處理被DNA污染的RNA樣品時(shí)，其產(chǎn)生的寡核苷酸片段會(huì)產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增，一般會(huì)顯示為彌散背景。

　　5. 產(chǎn)生大分子量的彌散條帶

　　*大多數(shù)情況下是由于退火溫度過低而導(dǎo)致的非特異性的起始及延伸產(chǎn)生的

　　*對(duì)于長(zhǎng)片段的PCR，建議將反應(yīng)體系中cDNA的濃度稀釋至1:10(或1:100-1:200)

　　6. 在無(wú)反轉(zhuǎn)錄酶的情況下，對(duì)照RNA獲得擴(kuò)增結(jié)果

　　*通常是由于對(duì)照RNA中含有痕量DNA而導(dǎo)致的。由于進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄時(shí)不可能將所有的DNA模板消除。建議可將第一鏈cDNA稀釋1:10、1:100、1:1000倍以消除DNA污染所造成的影響。

　　*有可能是引物二聚體的條帶

　　7. 擴(kuò)增產(chǎn)物滯留在加樣孔中

　　*有可能是由于模板量過高而導(dǎo)致PCR結(jié)果產(chǎn)生了高分子量的DNA膠狀物。建議將第一鏈結(jié)果至少稀釋100倍再進(jìn)行二次擴(kuò)增。

　　*另外，在二次PCR時(shí)使用的退火溫度如果比引物的Tm值低5℃，可以將退火溫度適當(dāng)增高或進(jìn)行熱啟動(dòng)以提高特異性。

　　8. SSⅢ與SSⅡ有何不同?

　　*具有更高的熱穩(wěn)定性(達(dá)50℃)

　　*具有更長(zhǎng)的半衰期(達(dá)220分鐘)

　　*對(duì)PCR無(wú)抑制

　　*干冰運(yùn)輸

　　*Tdt活性更低

　　9. 為什么有人更喜歡用SSⅢ而不是ThermoScript?

　　ThermoScript如果保存不當(dāng)會(huì)引起活性很快降低，SSⅢ則更穩(wěn)定。

　　10. 為什么使用基因特異性引物(GSP)?

　　GSP在擴(kuò)增低豐度的轉(zhuǎn)錄本時(shí)是最好的。OligodT引物建議用于高質(zhì)量RNA及全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄本的逆轉(zhuǎn)錄;隨機(jī)引物用于mRNA片段的逆轉(zhuǎn)錄。

　　11. 什么情況下需要使用RNase H?

　　在第一輪PCR中RNA/DNA雜合體不能正常變性時(shí)

　　12. 根據(jù)不同的目的選擇不同的系統(tǒng)：

　　目的 建議

　　RT與PCR使用不同的引物

　　或需要靈活選擇PCR DNA聚合酶 兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高靈敏度 一步法或兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高特異性 含有適當(dāng)?shù)腄NA聚合酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　或具有高保真Platinum Taq酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

　　高保真度 含有Pfx Taq酶的兩步法RT-PCR系統(tǒng)

　　長(zhǎng)的反轉(zhuǎn)錄結(jié)果 通常使用兩步法RT-PCR系統(tǒng)可達(dá)到最佳結(jié)果

　　含Elongase酶的一步法RT-PCR系統(tǒng)

　　二、Generacer

　　1. 如何針對(duì)Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)

　　*23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對(duì)照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來(lái)解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。

　　3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對(duì)照來(lái)確定。

　　4. 得不到全長(zhǎng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　二、Generacer

　　1. 如何針對(duì)Generacer試劑盒設(shè)計(jì)基因特異性引物(GSP)?

　　使用5’或3’RACE試劑都需要至少一條基因特異性引物，您在設(shè)計(jì)引物時(shí)需要注意以下幾點(diǎn)要求：

　　*50-70%的GC含量，以提高引物熔點(diǎn)(Tm)

　　*23-28個(gè)堿基長(zhǎng)度，以提高引物特異性

　　*降低3’端GC含量，將引物非特異性結(jié)合的可能性降至最低

　　2. 為什么得不到RACE產(chǎn)物?

　　*加入Hela對(duì)照

　　*低質(zhì)量的RNA模板

　　*逆轉(zhuǎn)錄失敗，SSII和SSIII非常適用于長(zhǎng)模板cDNA的合成

　　*目的基因豐度太低，可以通過提高PCR的循環(huán)次數(shù)來(lái)解決，建議使用巢式PCR

　　*目的基因沒有表達(dá)，可以通過使用兩條GSPs來(lái)分析cDNA中是否含有目的基因

　　*目的基因太長(zhǎng)而不適合進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，建議使用GeneRacer試劑盒中的Oligo dT來(lái)得到全長(zhǎng)cDNA，使用隨機(jī)引物或與模板的5’端盡可能近的GSP進(jìn)行PCR。

　　*cDNA模板屬于困難模板，可以通過以下方法解決：優(yōu)化PCR反應(yīng)參數(shù)及反應(yīng)體系;降低退火溫度;使用5-10%的DMSO幫助通過高GC含量區(qū);使用高保真度和高延伸能力的酶進(jìn)行PCR反應(yīng)。

　　3. RACE的PCR結(jié)果有雜帶

　　RACE PCR雜帶或非特異性PCR條帶可能是由于以下原因：

　　*GSP與其他cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致在擴(kuò)增目的產(chǎn)物時(shí)得到無(wú)關(guān)產(chǎn)物。

　　*GeneRacer引物和cDNA的非特異性結(jié)合會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生一端帶有GeneRacer引物序列的PCR產(chǎn)物。

　　*RNA降解。

　　*PCR管或試劑污染。

　　注意：雜帶一般是因?yàn)闆]有優(yōu)化PCR條件，可以加入陰性對(duì)照來(lái)確定。

　　4. 得不到全長(zhǎng)的5’RACE PCR產(chǎn)物

　　*CIP反應(yīng)后的RNA降解產(chǎn)生了新的帶有5’磷酸的斷裂模板，可以同GeneRacer RNA Oligo連接。一定要小心操作，保證RNA無(wú)降解。

　　*CIP脫磷酸不完全，可以增加反應(yīng)中CIP的量或減少RNA的量。

　　*PCR產(chǎn)生了雜帶，并不是真正的連接產(chǎn)物，可以使用上述建議優(yōu)化PCR。

　　三、PCR

　　在進(jìn)行PCR時(shí)：

　　*請(qǐng)確保您沒有使用過量的起始DNA或者過高濃度的引物，也沒有加入過量的Mg++

　　*請(qǐng)確保您使用了恰當(dāng)?shù)耐嘶饻囟?

　　*請(qǐng)確保您沒有使用過量的DNA聚合酶

　　四、引物

　　1. 應(yīng)該選擇哪種純化方法?

　　取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵锏拈L(zhǎng)度

　　2. 為什么我訂購(gòu)了50nmol，但是收到卻只有40nmol?

　　50nmol是起始量

　　3. 怎樣制備100μM的儲(chǔ)液?

　　體積(μl)=質(zhì)檢報(bào)告上的nmol數(shù)目×10

　　4. 怎樣設(shè)計(jì)引物?

　　*一般長(zhǎng)度20-30bp;

　　*至少50%的GC含量;

　　*避免引物二聚體和二級(jí)結(jié)構(gòu);

　　*引物對(duì)的Tm值應(yīng)該接近。

　　5. 引物序列有插入或缺失?

　　*使用上游和下游引物多測(cè)幾個(gè)克隆。

　　*請(qǐng)選擇正確的純化方法。

　　6. PCR無(wú)結(jié)果?

　　*請(qǐng)檢查引物設(shè)計(jì)是否正確;

　　*請(qǐng)檢測(cè)OD讀數(shù)是否正確;

　　*做一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照和一個(gè)陰性對(duì)照