利用紫外-可見吸收光譜來進(jìn)行定量分析由來已久，可追溯到古代，公元60年古希臘已經(jīng)知道利用五味子浸液來估計醋中鐵的含量，這一古老的方法由于最初是運(yùn)用人眼來進(jìn)行檢測，所以又稱比色法。到了16、17世紀(jì)，相關(guān)分析理論開始蓬勃發(fā)展，1852年，比爾(Beer)參考了布給爾(Bouguer)1729年和朗伯(Lambert)在1760年所發(fā)表的文章，提出了分光光度的基本定律，即液層厚度相等時，顏色的強(qiáng)度與呈色溶液的濃度成比例，從而奠定了分光光度法的理論基礎(chǔ)，這就是著名的朗伯-比爾定律。

　　儀器形成

　　吸光光度法也稱做分光光度法，但是分光光度法的概念有些含糊，分光光度是指儀器的功能，即儀器進(jìn)行分光并用光度法測定，這類儀器包括了分光光度計與原子吸收光譜儀(AAS)。吸光光度法的本質(zhì)是光的吸收，因此稱吸光光度法比較合理，當(dāng)然，稱分子吸光光度法是最確切的。

　　紫外-可見吸收光譜是物質(zhì)中分子吸收200-800nm光譜區(qū)內(nèi)的光而產(chǎn)生的。這種分子吸收光譜產(chǎn)生于價電子和分子軌道上的電子在電子能級躍遷(原子或分子中的電子，總是處在某一種運(yùn)動狀態(tài)之中。每一種狀態(tài)都具有一定的能量，屬于一定的能級。這些電子由于各種原因(如受光、熱、電的激發(fā))而從一個能級轉(zhuǎn)到另一個能級，稱為躍遷。)當(dāng)這些電子吸收了外來輻射的能量就從一個能量較低的能級躍遷到一個能量較高的能級。因此，每一躍遷都對應(yīng)著吸收一定的能量輻射。具有不同分子結(jié)構(gòu)的各種物質(zhì)，有對電磁輻射顯示選擇吸收的特性。吸光光度法就是基于這種物質(zhì)對電磁輻射的選擇性吸收的特性而建立起來的，它屬于分子吸收光譜。躍遷所吸收的能量符合波爾條件：

　　應(yīng)用范圍

　　紫外-可見分光光度計可用于物質(zhì)的定量分析、結(jié)構(gòu)分析和定量分析。而且還能測定某些化合物的物理化學(xué)參數(shù)，如摩爾質(zhì)量、配合物的配合比例和穩(wěn)定常熟、酸堿電離常數(shù)等。

　　1.定性分析

　　緊外-可見分光光度法對無機(jī)元素的定性分析應(yīng)用較少，無機(jī)元素的定性分析可用原子發(fā)射光譜法或化學(xué)分析的方法。在有機(jī)化合物的定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析中，由于紫外-可見光譜較簡單，特征性不強(qiáng)，因此該法的應(yīng)用也有一定的局限性。但是它適用于不飽和有機(jī)化合物。尤其是共軛體系的鑒定，以此推斷未知物的骨架結(jié)構(gòu)。此外，可配合紅外光譜、核磁共振波譜法和質(zhì)譜法進(jìn)行定性鑒定和結(jié)構(gòu)分析，因此它仍不失為是一種有用的輔助方法。

　　一般有兩種定性分析方法，比較吸收光譜曲線和用經(jīng)驗規(guī)則計算最大吸收波長λmax，然后與實測值進(jìn)行比較。

　　2.結(jié)構(gòu)分析

　　結(jié)構(gòu)分析可用來確定化合物的構(gòu)型和構(gòu)象。如辨別順反異構(gòu)體和互變異構(gòu)體。

　　3.定量分析

　　紫外-可見分光光度定量分析的依據(jù)是Lambert-Beer定律，即在一定波長處被測定物質(zhì)的吸光度與它的溶度呈線性關(guān)系。應(yīng)此，通過測定溶液對一定波長入射光的吸光度可求出該物質(zhì)在溶液中的濃度和含量。種常用的測定方法有：單組分定量法、多組分定量法、雙波長法、示差分光光度法和導(dǎo)數(shù)光譜法等。

　　4.配合物組成及其穩(wěn)定常數(shù)的測定

　　測量配合物組成的常用方法有兩種：摩爾比法(又稱飽和法)和等摩爾連續(xù)變化法(又稱Job法)。

　　5.酸堿離解常數(shù)的測定

　　光度法是測定分析化學(xué)中應(yīng)用的指示劑或顯色劑離解常數(shù)的常用方法，該法特別適用于溶解度較小的弱酸或弱堿。

　　分類

　　紫外-可見分光光度計的類型很多，但可歸納為三種類型：單光束分光光度計、雙光束分光光度計和雙波長分光光度計。

　　單光束分光光度計

　　其光路示意圖如前圖(紫外-可見分光光度計的基本結(jié)構(gòu)圖)所示，經(jīng)單色器分光后的一束平行光，輪流通過參比溶液和樣品溶掖，以進(jìn)行吸光度的測定。這種類型的分光光度計結(jié)構(gòu)簡單，操作方便，維修容易，適用于常規(guī)分析。國產(chǎn)722型，751型、724型、英國SP500型以及BackmanDU-8型等均屬于此類光度計。

　　雙光束分光光度計

　　其光路示意如下圖所示，經(jīng)單色器分光后經(jīng)反射鏡(M1)分解為弧度相等的兩束光，一束通過參比池，另一束通過樣品池。光度計能自動比較兩束光的強(qiáng)度，此比值即為試樣的透射比，經(jīng)對數(shù)變換將它轉(zhuǎn)換成吸光度并作為波長的函數(shù)記錄下來。雙光束分光光度計一般都能自動記錄吸收光譜曲線。由于兩束光同時分別通過參比池和樣品他，還能自動消除光源強(qiáng)度變化所引起的誤差。這類儀器有國產(chǎn)710型、730型和740型，日立220系列，島津-210，英國UNICAMSP-700等等。

　　雙波長分光光度計

　　其基本光路如下圖所示。由同一光源發(fā)出的光被分成兩束，分別經(jīng)過兩個單色器，得到兩束不同波長的單色光;再利用切光器使兩束光以一定的頻率交替照射同一吸收池，然后經(jīng)過光電倍增管和電子控制系統(tǒng)，最后由顯示器顯示出兩個波長處的吸光度差值ΔA(ΔA=A1-A2)。

　　雙波長分光光度計的優(yōu)點：對于多組分混合物、混濁試樣(如生物組織液)的分析，以及存在背景于擾或共存組分吸收干擾的情況下，利用雙波長分光光度法，往往能提高方法的靈敏度和選擇性。利用雙波長分光光度計，能獲得導(dǎo)數(shù)光譜。通過光學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，使雙波長分光光度計能很方便地轉(zhuǎn)化為單波長工作方式。如果能在兩波長處分別記錄吸光度隨時間變化的曲線，還能進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)研究。