【摘要】研究了反相液相色譜中負(fù)峰現(xiàn)象及產(chǎn)生的原理，應(yīng)用計(jì)量置換作用原理解釋了樣品在色譜柱中的計(jì)量置換保留行為;應(yīng)用負(fù)峰法測試了甲基脂肪酮各組分的含量。本研究采用AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)，流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水,含0.01mmol/L磺基水楊酸)=60∶40，紫外檢測器(λsig=310nm，λref=275nm)。本方法簡便，線性相關(guān)系數(shù)r均大于0.9993;甲基酮的定量下限為0.041μg;相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.52%～0.80%。

　　【關(guān)鍵詞】反相高效液相色譜;負(fù)峰法;計(jì)量置換;甲基酮

　　1引言

　　反相液相色譜中負(fù)峰測定法是一種間接光度檢測方法，廣泛應(yīng)用于離子色譜和毛細(xì)管電泳中，檢測對(duì)象基本是離子型化合物[1～5]，對(duì)于其作用機(jī)理也有相關(guān)解釋[3～5]。而由于缺乏合理的理論解釋，間接光度反相液相色譜未得到很好的應(yīng)用。色譜計(jì)量置換機(jī)理[6]即一個(gè)溶質(zhì)分子被吸附劑吸附的同時(shí)，必伴隨著一定計(jì)量數(shù)目的溶劑分子離開溶質(zhì)分子與吸附劑的界面而返回到溶液中。這個(gè)理論很好地解釋了間接光度反相液相色譜測定中出現(xiàn)的負(fù)峰現(xiàn)象。若應(yīng)用紫外檢測器，樣品分子是無紫外吸收或弱紫外吸收的分子，流動(dòng)相含有紫外吸收分子，則在色譜分離過程中樣品分子與固定相上吸附的紫外吸收分子發(fā)生置換使其返回到流動(dòng)相中，相應(yīng)譜帶的紫外吸收分子濃度降低，檢測器檢測出負(fù)峰(即弱吸收峰)信號(hào)。因此，負(fù)峰法使紫外檢測器可應(yīng)用于無紫外吸收或弱紫外吸收的物質(zhì)的分析測定。醛酮分子在紫外區(qū)有很微弱的吸收，用紫外檢測器一般很難直接測定。通常，醛酮的測定需利用氨化還原反應(yīng)在其還原端接上有紫外吸收的基團(tuán)，例如2,4二硝基苯肼衍生測定法[7,8]。若能借鑒色譜中的計(jì)量置換機(jī)理，采用間接光度技術(shù)直接測定醛酮，則可消除衍生化操作帶來的麻煩和誤差。文獻(xiàn)[9]應(yīng)用負(fù)峰測定法測定乙酸酯，文獻(xiàn)[5]報(bào)道了間接光度色譜法，但用計(jì)量置換機(jī)理解釋反相液相色譜溶質(zhì)溶劑作用關(guān)系，及負(fù)峰法測定酮類物質(zhì)尚未見報(bào)道。

　　本實(shí)驗(yàn)在流動(dòng)相中加入吸光物質(zhì)作為本底試劑，用負(fù)峰法測定甲基脂肪酮類化合物，系統(tǒng)研究了色譜分析條件。本實(shí)驗(yàn)用計(jì)量置換作用機(jī)理解釋了反相液相色譜測定中出現(xiàn)的負(fù)峰現(xiàn)象。研究表明，在液相色譜分析時(shí)紫外檢測器也可用于無紫外吸收物質(zhì)的測定。

　　2實(shí)驗(yàn)部分

　　2.1儀器與試劑

　　HP1100液相色譜儀(美國惠普公司)，配DAD二極管陣列檢測器、HPChemstation化學(xué)工作站、AgilentC18色譜柱(150mm×4.6mm,5μm)。

　　甲醇(色譜純，F(xiàn)isherScientific公司);丙酮(天津市富于精細(xì)化工有限公司);丁酮(天津化學(xué)試劑六廠);甲基異丙基甲酮(上海試劑一廠);甲基異丁基甲酮、對(duì)苯二酚(西安化學(xué)試劑廠);水楊酸(新中化學(xué)廠);磺基水楊酸(廣州化學(xué)試劑廠);N,N二甲基乙酰胺(成都市聯(lián)合化工試劑研究所)，上述試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

　　2.2實(shí)驗(yàn)方法

　　用含確定量本底試劑的流動(dòng)相平衡儀器至基線平直，在選定色譜條件下，對(duì)樣品進(jìn)行分析。

　　3結(jié)果與討論

　　3.1流動(dòng)相的選擇

　　實(shí)驗(yàn)中采用二元流動(dòng)相，向流動(dòng)相中加入適量的本底試劑，在流動(dòng)相中甲醇與本底試劑水溶液的體積比分別為70∶30，60∶40，50∶50，40∶60和30∶70，對(duì)甲基酮系列樣品混合溶液進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)V(甲醇)∶V(本底試劑水溶液)=60∶40時(shí)，各組分能達(dá)到很好地分離，而且分析時(shí)間短。因此本實(shí)驗(yàn)采用V(甲醇)∶V(本底試劑水溶液)=60∶40為流動(dòng)相進(jìn)行樣品測定。

　　3.2本底試劑的選擇

　　基于本底試劑的化學(xué)性質(zhì)和極性，本實(shí)驗(yàn)考察了對(duì)苯二酚、水楊酸、磺基水楊酸、N,N二甲基甲酰胺作為本底試劑時(shí)，甲基酮的檢出限和儀器平衡時(shí)間。磺基水楊酸的極性較強(qiáng)，平衡時(shí)間短，而且檢出限低，結(jié)果如表1所示。本實(shí)驗(yàn)最終以磺基水楊酸為本底試劑。表1本底試劑與平衡時(shí)間和最低檢測量的關(guān)系(略)

　　3.3負(fù)峰產(chǎn)生機(jī)理及檢測波長的選擇

　　實(shí)驗(yàn)向流動(dòng)相中加入磺基水楊酸作為強(qiáng)紫外吸收的本底試劑，用這種流動(dòng)相平衡儀器至基線平直。因?yàn)榇治鰳悠芳谆就侨踝贤馕瘴镔|(zhì)，所以當(dāng)樣品進(jìn)樣后，甲基酮分子把原來吸附在固定相上的部分流動(dòng)相分子(包括甲醇、水和加入的本底試劑分子)置換出來，使得固定相上對(duì)應(yīng)甲基酮分子譜帶的磺基水楊酸濃度低于其它分子譜帶。由于此方法檢測的吸光度為磺基水楊酸濃度變化的凈吸光度，因此流出色譜柱經(jīng)過檢測器時(shí)測得比基線小的吸光度，紫外檢測器檢測出負(fù)峰信號(hào)。

　　本實(shí)驗(yàn)以甲基酮的吸收波長275nm作為參比波長，改變檢測波長對(duì)樣品進(jìn)行測定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，基線噪音和信噪比隨檢測波長而變化，噪音小，信噪比大，檢測靈敏度高。

　　如圖1和圖2所示，檢測波長高于260nm噪音較小且無明顯變化;310nm時(shí)信噪比最大。實(shí)驗(yàn)選擇的本底試劑為磺基水楊酸，經(jīng)測定其最大吸收波長為296nm，而樣品的最大吸收波長在275nm附近。如果選擇檢測波長為296nm，樣品信號(hào)峰最大，但噪音略大，則信噪比較小。由于實(shí)驗(yàn)測定的是本底試劑吸光度的減少值，磺基水楊酸最大吸收波長296nm靠近樣品的最大吸收波長，而310nm距其相對(duì)較遠(yuǎn)，所以檢測波長為310nm時(shí)，ΔA較296nm時(shí)略大，信噪比也較大。因此實(shí)驗(yàn)選擇310nm為檢測波長。此時(shí)噪音小，信噪比大，靈敏度高。

　　3.4本底試劑濃度的選擇

　　將本底物質(zhì)加入流動(dòng)相中，會(huì)使得基線噪音增大，所以選擇本底試劑的濃度應(yīng)盡可能低;但如果其濃度太低，將降低檢測的靈敏度。本實(shí)驗(yàn)分別配制本底試劑濃度0.005，0.01，0.02和0.05mmol/L的流動(dòng)相，平衡儀器至基線平直，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。由圖3所示，基線噪音隨本底物質(zhì)濃度變化較大，且當(dāng)本底物質(zhì)濃度為0.01mmol/L時(shí)，噪音最小，最小檢測量最低。所以，確定流動(dòng)相中所加的磺基水楊酸的濃度為0.01mmol/L。

　　3.5甲基酮系列分離

　　準(zhǔn)確量取丙酮、丁酮、甲基異丙基甲酮和甲基異丁基甲酮各100μL于10mL容量瓶中，用本底試劑濃度為0.01mmol/L的流動(dòng)相作為溶劑加至刻度，搖勻。取10μL此甲基酮混合溶液進(jìn)樣進(jìn)行色譜分離(圖4)，分離結(jié)果良好，以上各物質(zhì)的分離度均大于1.5，峰形良好。

　　3.6線性關(guān)系、精密度和檢出限

　　峰面積和進(jìn)樣量成正比，是色譜定量分析的依據(jù)。本方法是根據(jù)色譜過程樣品組分對(duì)本底試劑的置換作用建立的，測定的是負(fù)峰，為考察負(fù)峰面積與進(jìn)樣量間的關(guān)系，在本文選定的色譜條件下，取上述甲基酮溶液分別進(jìn)樣2，4，6，8和10μL。將所測得的峰面積與對(duì)應(yīng)酮的絕對(duì)量進(jìn)行線性回歸，丙酮、丁酮、甲基異丙基甲酮、甲基異丁基甲酮的峰面積A與其絕對(duì)進(jìn)樣量x的工作曲線分別為：A=226.19x-123.62，A=230.24x-98.855，A=218.65x-110.01，A=179.63x-45.128，線性相關(guān)系數(shù)r分別為0.9993，0.9995，0.9997，0.9996。因此，此方法可以準(zhǔn)確進(jìn)行定量分析。

　　準(zhǔn)確吸取10μL上述甲基酮溶液進(jìn)行平行測定，結(jié)果見表2。采用逐步稀釋測定信噪比為3∶1時(shí)，甲基酮的定量下限為0.041μg。表2混合樣品測定結(jié)果(略)

　　4結(jié)論

　　色譜負(fù)峰測定法反映了物質(zhì)在色譜分離過程中存在一定的計(jì)量置換作用，從實(shí)驗(yàn)上支持了計(jì)量置換理論;從研究所采用的技術(shù)可見，用HPLC紫外檢測器可用于測定無紫外吸收的物質(zhì)，擴(kuò)大了紫外檢測器的應(yīng)用范圍;分析中直接檢測的是加入的本底試劑的吸光度減少值，因此，只要能確定待測物質(zhì)與加入物質(zhì)的計(jì)量關(guān)系，即可在沒用標(biāo)準(zhǔn)樣品的情況下定量分析樣品。