前言

　　本標準附錄A為資料性附錄。

　　本標準由浙江省海洋與漁業(yè)局提出并歸口。

　　本標準起草單位：農(nóng)業(yè)部漁業(yè)環(huán)境及水產(chǎn)品質(zhì)檢中心(舟山)。

　　本標準主要起草人：鄭斌、陳雪昌、劉士忠、金彩杏、鐘志、劉琴。

　　水產(chǎn)品中磺胺類殘留量的測定液相色譜法

　　范圍

　　本標準規(guī)定了水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的液相色譜測定方法。

　　本標準適用于水產(chǎn)品中磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和磺胺甲基異噁唑殘留量的測定，其它磺胺類藥物的測定可以參照本標準。

　　規(guī)范性引用文件

　　下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單(不包括勘誤的內(nèi)容)或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。

　　GB/T6682分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法

　　原理

　　用乙酸乙酯提取，稀鹽酸反提取，正己烷脫脂，熒光胺衍生，反相色譜柱分離，熒光檢測器檢測，磺胺5-甲氧嘧啶為內(nèi)標物，內(nèi)標法定量。

　　試劑

　　本標準所用試劑在磺胺類藥物出峰處應無干擾峰，實驗用水應符合GB/T6682中一級水標準。

　　標準品：磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶、磺胺甲基異噁唑，磺胺5-甲氧嘧啶，純度均大于98.0%。

　　丙酮：色譜純。

　　正己烷：色譜純。

　　乙酸乙酯：色譜純。

　　乙腈：色譜純。

　　甲醇：色譜純。

　　熒光胺：純度大于99.0%。

　　乙酸鈉：分析純。

　　冰乙酸：優(yōu)級純。

　　鹽酸溶液：2mol/L，量取180mL鹽酸，加適量水并稀釋至1000mL。

　　乙酸鈉溶液：3.5mol/L，稱取28.7g無水乙酸鈉溶于蒸餾水中，定容至100mL。

　　熒光胺溶液：2mg/L，稱取0.03g熒光胺，加15mL丙酮，振搖至完全溶解，存放在暗處�，F(xiàn)配現(xiàn)用。

　　標準儲備液：100mg/L，稱取標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

　　混合標準中間液：1mg/L，移取標準儲備液各1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

　　內(nèi)標儲備液：100mg/L，稱取磺胺5-甲氧嘧啶標準品10mg(稱準至0.1mg)，用甲醇溶解并定容至100mL。避光冷藏保存，保存期為一個月。

　　內(nèi)標中間液：1mg/L，移取內(nèi)標儲備液1.00mL，用甲醇稀釋并定容至100mL，在室溫下混勻。

　　混合標準使用液：取混合標準中間液20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，分別加入內(nèi)標中間液100μL，用2mol/L鹽酸(4.10)稀釋至2mL，配成濃度分別為0.01mg/L、0.02mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.20mg/L的混合標準使用液，其中內(nèi)標濃度為0.05mg/L。

　　儀器與設備

　　液相色譜儀：配熒光檢測器。

　　電子天平：感量0.0001g。

　　電子天平：感量0.01g。

　　高速組織搗碎機。

　　均質(zhì)機。

　　離心機。

　　旋渦混勻器。

　　氮吹儀。

　　往復式振蕩器。

　　聚丙烯離心管：15mL、50mL。

　　容量瓶：10mL、20mL、50mL、100mL、200mL、500mL、1000mL。

　　玻璃移液管：1mL、2mL、5mL、10mL。

　　巴斯德吸管。

　　色譜條件

　　色譜柱：ODS-C18，5μm，4.6mm×250mm，或同類型號色譜柱。

　　柱溫：45℃。

　　流動相：乙腈 乙酸溶液(38 62)，500mL水中加入冰乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0配制成乙酸溶液。

　　流速：1mL/min

　　進樣量：20μL。

　　激發(fā)波長：405nm。

　　發(fā)射波長：495nm。

　　步驟分析

　　樣品制備

　　從原始樣品中取出部分有代表性的樣品，高速組織搗碎機搗碎。四分法縮分出不少于500g樣品，混勻，均分成兩份。裝入清潔容器，加封，標明標記。-18℃以下冷凍保存。

　　提取

　　將樣品解凍，稱取2.00g，置于50mL聚丙烯離心管，加入磺胺5-甲氧嘧啶標準中間液(4.16)100μL，用玻璃棒攪勻，再加乙酸乙酯10mL，均質(zhì)機14000rpm均質(zhì)1min，往復式振蕩器振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至2mL。再向原離心管中加入乙酸乙酯10mL，旋渦混勻30s，振動10min，3000rpm離心10min，將乙酸乙酯層小心轉(zhuǎn)移到原15mL具塞刻度試管中，40℃以下氮氣吹至5mL。然后在試管中加入2.00mL2mol/L的鹽酸溶液，旋渦混勻1min，加蓋后振動10min，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去乙酸乙酯層，在余液中加入正己烷5mL，旋渦混勻30s，3000rpm離心8min，用巴斯德吸管移去正己烷層，0.45μm微孔濾膜過濾，濾液備用。

　　衍生

　　向樣品瓶中加入200μL混合標準使用液或樣品提取液、200μL乙酸鈉溶液和80μL熒光胺溶液，旋渦混勻30s，20min后供液相色譜分析。

　　色譜分析

　　取衍生后的樣品提取液20μL進樣，記錄峰面積，響應值均應在儀器檢測的線性范圍之內(nèi)。根據(jù)標準樣品的保留時間定性，內(nèi)標法定量�；前奉愃幬锷V分析圖參見附錄A。

　　工作曲線

　　稱取空白樣品2.00g，分別添加混合標準中間液(4.14)20μL、40μL、100μL、200μL、400μL，樣品中每種磺胺殘留量分別為0.01mg/kg、0.02mg/kg、0.05mg/kg、0.10mg/kg、0.20mg/kg，按7.2、7.3、7.4操作，以磺胺峰面積與內(nèi)標物峰面積的比值為縱坐標，磺胺含量為橫坐標，繪制工作曲線。

　　計算

　　用色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按下式計算樣品中磺胺殘留量：

　　式中：

　　X——樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg);

　　s——樣品溶液中磺胺峰面積，單位為counts;

　　s1——樣品溶液中內(nèi)標峰面積，單位為counts;

　　S——標準溶液中磺胺峰面積，單位為counts;

　　S1——標準溶液中內(nèi)標峰面積，單位為counts;

　　x——加標樣品中磺胺殘留量，單位為毫克每千克(mg/kg)。

　　方法回收率

　　濃度范圍為0.010mg/kg～0.10mg/kg時，回收率見回收率表。

　　回收率表

　　名稱

　　回收率

　　磺胺嘧啶

　　88.0%～111.8%

　　磺胺甲基嘧啶

　　90.0%～110.8%

　　磺胺二甲基嘧啶

　　91.0%～110.1%

　　磺胺甲基異噁唑

　　107.0%～116.7%

　　方法檢出限

　　本方法檢出限為0.010mg/kg。

　　精密度

　　在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術平均值的15%。