一、免疫標(biāo)記法及其分類

　　1.熒光免疫法

　　原理是應(yīng)用一對(duì)單克隆抗體的夾心法。底物用磷酸-4-甲基傘形酮，檢測(cè)產(chǎn)物發(fā)出的熒光，熒光強(qiáng)度與Mb濃度呈正比，可在8min內(nèi)得出結(jié)果。結(jié)果以Mb每小時(shí)釋放的速率表示(△Mb)表示。該法重復(fù)性好，線性范圍寬，具有快速、敏感、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。

　　以雙抗夾心法為例，首先將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體。除去未結(jié)合抗體，然后加受檢標(biāo)本，使其中的蛋白抗原與固相抗體形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合物，接著加入熒光標(biāo)記的抗體，使之與抗原特異性結(jié)合，形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物。最后根據(jù)熒光強(qiáng)度，即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。

　　傳統(tǒng)的熒光免疫法受本底熒光的干擾較大，時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定法是以具有特長(zhǎng)壽命的稀土金屬如銪，作為標(biāo)記物，加入正常液后激發(fā)測(cè)定，能有效去除短壽命本底熒光的干擾。

　　2.放射免疫法

　　放射免疫法是以過量的未標(biāo)記抗原與放射性物質(zhì)標(biāo)記的抗原，競(jìng)爭(zhēng)性地與抗體結(jié)合，形成有放射性的抗原—抗體復(fù)合物與無放射性的抗原—抗體復(fù)合物，并有過剩的標(biāo)記抗原與未標(biāo)記的抗原。然后通過離心沉淀等方法，將抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原分離，分別測(cè)定其放射性強(qiáng)度與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，即可對(duì)未標(biāo)記的待測(cè)抗原進(jìn)行定量。

　　RIA法測(cè)定血清蛋白靈敏度高、特異性強(qiáng)，可準(zhǔn)確定量到ng/ml水平。但早期的方法操作麻煩，耗時(shí)長(zhǎng)，且有放射性污染。近年來，隨著單克隆抗體的應(yīng)用，RIA的靈敏度又有了較大提高，且操作大為簡(jiǎn)化，并已有商品試劑盒供應(yīng)，使用方便。

　　3.酶聯(lián)免疫法(ELISA)

　　ELISA法有競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法兩種。競(jìng)爭(zhēng)法是基于標(biāo)準(zhǔn)或血清Mb和微孑L板上包被的Mb競(jìng)爭(zhēng)性地與單克隆抗體相結(jié)合的原理而建立，該法的最低檢測(cè)限為10μg/L，線性范圍達(dá)1 000ug/L。夾心ELISA法與EIA具有良好的相關(guān)性(r=0.92)。ELISA法具有靈敏度高，特異性強(qiáng)，精密度好，操作簡(jiǎn)單，適用于多份標(biāo)本的檢測(cè)，不需特殊儀器設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)，易于推廣普及。但不適合急診的快速檢測(cè)。

　　以雙抗法為例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗與包被抗原形成抗原—抗體復(fù)合物。接著加入酶標(biāo)二抗，形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物。最后加入底物，由酶催化底物生成產(chǎn)物。通過產(chǎn)物的生成量即可對(duì)蛋白抗原進(jìn)行定量。

　　4.偶聯(lián)生物素—親和素系統(tǒng)的酶免法

　　利用了一個(gè)親和素分子可以與4個(gè)生物素分子結(jié)合的特性，使傳統(tǒng)的靈敏度較高的酶免法的靈敏度又有明顯的放大作用。

　　5.時(shí)間分辨熒光免疫分析

　　時(shí)間分辨熒光免疫分析(Time resolved Fluor immunoassay，TRFIA)是一種非同位素免疫分析技術(shù)，它用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效地排除非特異熒光的干擾，極大地提高了分析靈敏度。

　　6.解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?

　　解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治?Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是時(shí)間分辨熒光免疫分析中的一種。它用具有雙功能基團(tuán)結(jié)構(gòu)的螯合劑，使其一端與銪(Eu)連接，另一端與抗體/抗原分子上的自由氨基連接，形成EU標(biāo)記的抗體/抗原，經(jīng)過免疫反應(yīng)之后生成免疫復(fù)合物。由于這種復(fù)合物在水中的熒光強(qiáng)度非常弱，因此加入一種增強(qiáng)劑，使Eu3 從復(fù)合物上解離下來，自由Eu3 同增強(qiáng)劑中的另一種螯合劑螯合形成一種膠態(tài)分子團(tuán)，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號(hào)增強(qiáng)了百萬(wàn)倍。因?yàn)檫@種分析方法使用了解離增強(qiáng)步驟，因此稱為解離增強(qiáng)鑭系元素?zé)晒饷庖叻治觥?

　　二、熒光抗體染色方法及其分類

　　1.直接染色法

　　將標(biāo)記的特異熒光抗體直接加在抗原標(biāo)本上，經(jīng)一定溫度和時(shí)間的染色，洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體，在熒光顯微鏡下便可見到被檢抗原與熒光抗體形成的特異性結(jié)合物而發(fā)出的熒光。直接染色法的優(yōu)點(diǎn)是：特異性高，操作簡(jiǎn)便，比較快速。缺點(diǎn)是：一種標(biāo)記抗體只能檢查一種抗原，敏感性較差。直接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，抑制試驗(yàn)對(duì)照。

　　2.間接染色法

　　如果檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體(第一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，作用一定時(shí)間后，洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體即抗球蛋白抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng)，如果第一步中的抗原抗體互相發(fā)生了反應(yīng)，則抗體被固定或與熒光素標(biāo)記的抗抗體結(jié)合，形成抗原-抗體-抗抗體復(fù)合物，再洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗抗體，在熒光顯微鏡下可見熒光。在間接染色法中，第一步使用的未用熒光素標(biāo)記的抗體起著雙重作用，對(duì)抗原來說起抗體的作用，對(duì)第二步的抗抗體又起抗原作用。如果檢查未知抗體則抗原標(biāo)本為已知的待檢血清為第一抗體，基他步驟和檢查抗原相同。

　　由于免疫球蛋白有種屬特異性，因此標(biāo)記的抗球蛋白抗體必須用第一抗體同種的動(dòng)物血清球蛋白免疫其他動(dòng)物來制備。

　　間接染色法的優(yōu)點(diǎn)是既能檢查未知抗原，也能檢查求知抗體;用一種標(biāo)記的抗球蛋白抗體，能與在種屬上相同的所有動(dòng)物的抗體結(jié)合，檢查各種未知抗原或抗體，敏感性高。缺點(diǎn)是：由于參加反應(yīng)的因素較多，受干擾的可能性也較大，判定結(jié)果有時(shí)較難，操作繁瑣，對(duì)照較多，時(shí)間長(zhǎng)。間接法應(yīng)設(shè)陰、陽(yáng)性標(biāo)本對(duì)照，還應(yīng)設(shè)有中間層對(duì)照(即中間層加陰性血清代替陽(yáng)性血清)。

　　3.抗補(bǔ)體染色法

　　抗補(bǔ)體染色法簡(jiǎn)稱補(bǔ)體法，是間接染色法的一種改良法，首先由Goldwasser等建立。本法利用補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)的原理，用熒光素標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，鑒定未知抗原或未知抗體(待檢血清)。染色程序也分二步：先將未標(biāo)記的抗體和補(bǔ)體加在抗原標(biāo)本上，使其發(fā)生反應(yīng)，水洗，然后再加標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體。如果第一步中抗原抗體發(fā)生反應(yīng)，形成復(fù)合物，則補(bǔ)體便被抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，第二步加入的熒光素標(biāo)記的抗補(bǔ)體抗體便與補(bǔ)體發(fā)生特異性反應(yīng)，使之形成抗原-抗體-補(bǔ)體-抗補(bǔ)體抗體復(fù)合物，發(fā)出熒光。

　　抗補(bǔ)體染色法具有和間接法相同的優(yōu)點(diǎn)，此外，還有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)：即只需要一種標(biāo)記抗補(bǔ)體抗體，便能檢測(cè)各種抗原-抗體系統(tǒng)。因?yàn)檠a(bǔ)體的作用沒有特異性，它可以與任何哺乳動(dòng)物的抗原-抗體系統(tǒng)發(fā)生反應(yīng)。它的缺點(diǎn)是參與反應(yīng)的成分多，染色程序較復(fù)雜，比較麻煩。

　　除上述三種方法外，還有在此基礎(chǔ)上演變出的一些方法，如雙層法、夾心法、混合法、三層法、抗體-抗補(bǔ)體法等等。