高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經(jīng)進(jìn)樣器進(jìn)入流動相,被流動相載入色譜柱(固定相)內(nèi),由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù),在兩相中作相對運動時,經(jīng)過反復(fù)多次的吸附-解吸的分配過程。

　　高效液相色譜(highperformanceliquidchromatography,HPLC)也叫高壓液相色譜(highpressureliquidchromatography)、高速液相色譜(highspeedliquidchromatography)、高分離度液相色譜(highresolutionliquidchromatography)等。是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于60年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒具有高柱效，但會引起高阻力，需用高壓輸送流動相，故又稱高壓液相色譜。又因分析速度快而稱為高速液相色譜。

　　高效液相色譜是目前應(yīng)用最多的色譜分析方法，高效液相色譜系統(tǒng)由流動相儲液體瓶、輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器和記錄器組成，其整體組成類似于氣相色譜，但是針對其流動相為液體的特點作出很多調(diào)整。HPLC的輸液泵要求輸液量恒定平穩(wěn);進(jìn)樣系統(tǒng)要求進(jìn)樣便利切換嚴(yán)密;由于液體流動相粘度遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于氣體，為了減低柱壓高效液相色譜的色譜柱一般比較粗，長度也遠(yuǎn)小于氣相色譜柱。HPLC應(yīng)用非常廣泛，幾乎遍及定量定性分析的各個領(lǐng)域。

　　使用高效液相色譜時，液體待檢測物被注入色譜柱，通過壓力在固定相中移動，由于被測物種不同物質(zhì)與固定相的相互作用不同，不同的物質(zhì)順序離開色譜柱，通過檢測器得到不同的峰信號，最后通過分析比對這些信號來判斷待側(cè)物所含有的物質(zhì)。高效液相色譜作為一種重要的分析方法，廣泛的應(yīng)用于化學(xué)和生化分析中。高效液相色譜從原理上與經(jīng)典的液相色譜沒有本質(zhì)的差別，它的特點是采用了高壓輸液泵、高靈敏度檢測器和高效微粒固定相，適于分析高沸點不易揮發(fā)、分子量大、不同極性的有機化合物。

　　發(fā)展歷史：

　　1960年代，由于氣相色譜對高沸點有機物分析的局限性，為了分離蛋白質(zhì)、核酸等不易氣化的大分子物質(zhì)，氣相色譜的理論和方法被重新引入經(jīng)典液相色譜。1960年代末科克蘭(Kirkland)、哈伯、荷瓦斯(Horvath)、莆黑斯、里普斯克等人開發(fā)了世界上第一臺高效液相色譜儀，開啟了高效液相色譜的時代。高效液相色譜使用粒徑更細(xì)的固定相填充色譜柱，提高色譜柱的塔板數(shù)，以高壓驅(qū)動流動相，使得經(jīng)典液相色譜需要數(shù)日乃至數(shù)月完成的分離工作得以在幾個小時甚至幾十分鐘內(nèi)完成。

　　1971年科克蘭等人出版了《液相色譜的現(xiàn)代實踐》一書，標(biāo)志著高效液相色譜法(HPLC)正式建立。在此后的時間里，高效液相色譜成為最為常用的分離和檢測手段，在有機化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥物開發(fā)與檢測、化工、食品科學(xué)、環(huán)境監(jiān)測、商檢和法檢等方面都有廣泛的應(yīng)用。高效液相色譜同時還極大的刺激了固定相材料、檢測技術(shù)、數(shù)據(jù)處理技術(shù)以及色譜理論的發(fā)展。

　　1960年代前，使用的填充粒大于100μm，提高柱效面臨著困境，后來的研究人員便采用微粒固定相來突破著一瓶頸�？瓶颂m、荷瓦斯制備成功薄殼型固定相，這種在固定相在玻璃微球表面具有多孔薄殼，實現(xiàn)了高速傳質(zhì)，為高效液相色譜技術(shù)的發(fā)展奠定了穩(wěn)固的基礎(chǔ)。隨著填料粒徑的降低，更高的柱效也得以實現(xiàn)。1960年代研制出氣動放大泵、注射泵及低流量往復(fù)式柱塞泵，但后者的脈沖信號很大，難以滿足高效液相色譜的要求。1970年代，往復(fù)式雙柱塞恒流泵，解決了這一問題。1970年代后科克蘭制備出全多孔球形硅膠，平均粒徑只有7μm，具有極好的柱效，并逐漸取代了無定形微粒硅膠。之后又制造出的鍵合固定相使柱的穩(wěn)定性大為提高，多次使用成為可能。1970年后，適合分離生物大分子的填料又成為研究的熱點。1980年后，改善分離的選擇性成為色譜工作者的主要問題，人們越來越認(rèn)識到改變流動相的組成事提高選擇性的關(guān)鍵。

　　高效液相色譜的特點：

　　高壓——壓力可達(dá)150～300kg/cm2。色譜柱每米降壓為75kg/cm2以上。

　　高速——流速為0.1～10.0mL/min。

　　高效——塔板數(shù)可達(dá)5000/米。在一根柱中同時分離成份可達(dá)100種。

　　高靈敏度——紫外檢測器靈敏度可達(dá)0.01ng。同時消耗樣品少。

　　HPLC與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點：

　　速度快——通常分析一個樣品在15～30min，有些樣品甚至在5min內(nèi)即可完成。

　　分辨率高——可選擇固定相和流動相以達(dá)到最佳分離效果。

　　靈敏度高——紫外檢測器可達(dá)0.01ng，熒光和電化學(xué)檢測器可達(dá)0.1pg。

　　色譜柱可反復(fù)使用——用一根色譜柱可分離不同的化合物。

　　樣品量少，容易回收——樣品經(jīng)過色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。