CSA法和改進(jìn)CSA法的敏感性和存在的問(wèn)題

　　提高IHC敏感性有幾種途徑。一是依靠各種IHC的前處理，例如酶的消化、高溫的抗原修復(fù)，雖然對(duì)其的基本原理不十分清楚，但卻十分實(shí)用;其次是增加IHC方法的放大倍數(shù)，主要是酶結(jié)合量的增加。例如EnVison法，一個(gè)EnVision葡聚糖多聚物結(jié)合100個(gè)左右的酶分子和15個(gè)抗體分子，要比二步法S-P(LSAB)上結(jié)合的酶分子多許多倍。

　　雖然EnVision法的敏感性大大提高，方法也簡(jiǎn)便，但其大分子對(duì)于核內(nèi)抗原的定位就不如LSAB法，存在穿透核膜困難的問(wèn)題。因而，有時(shí)EnVision法就不如LSAB法敏感，尤其是活細(xì)胞核內(nèi)抗原定位更為困難。CSA法的應(yīng)用，既克服了LSAB法敏感性不高的缺點(diǎn)，又保留了較好的細(xì)胞穿透性。

　　已有的研究結(jié)果證實(shí)(Hasui K，2005;倪燦榮等，1999)，CSA法較LSAB法敏感500—1000倍，較EnVision法敏感20～100倍。其對(duì)細(xì)胞周期素等核內(nèi)抗原的定位，有獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，定位準(zhǔn)確性、敏感性、穩(wěn)定性要較標(biāo)準(zhǔn)的CSA法好，其敏感性和穿透性要好于EnVision法。

　　最近，Hasui K等(2005)的研究結(jié)果表明，CSA法具有很高的敏感性的同時(shí)，也存在嚴(yán)重的內(nèi)源性物質(zhì)干擾(內(nèi)源性生物素、內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、第一抗體與組織細(xì)胞內(nèi)的不明物質(zhì)的非特異性結(jié)合)，尤其是經(jīng)抗原熱修復(fù)后情況更為嚴(yán)重。作者應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的EnVision法、CSA法和改進(jìn)(加阻斷劑)的CSA法檢測(cè)淋巴結(jié)、正常肝、肝細(xì)胞癌、胃腸道鱗癌及癌周正常組織中k167抗原，其檢測(cè)最佳效果的標(biāo)準(zhǔn)流程如下。

　　(1)4um石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS洗3x3min。

　　(2)首先用0.3%過(guò)氧化氫甲醇破壞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫20min。

　　(3)PBS洗3x3min。

　　(4)抗原修復(fù)，室溫冷卻20min。

　　(5)PBS洗3x3min。

　　(6)第二次用0.3%過(guò)氧化氫PBS破壞內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，室溫5min。

　　(7)用溫的(35℃)TBST[0.02mol/L(pH7.8)Tris—HCl+NaCl+0.1%Tween20]洗3x3min。

　　(8)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷第一抗體的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，10min，不洗。

　　(9)滴加適當(dāng)稀釋的第一抗體(在S-P法基礎(chǔ)上5—10倍稀釋)，或4℃過(guò)夜。

　　(10)PBS洗3x3min，溫的(35℃)TBST洗3x3min。37~C孵育15～60min，

　　(11)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷多聚物試劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，lOmin，不洗。

　　(12)多聚物(EnVision)孵育15min，溫?zé)?35℃)TBST洗3x3min。

　　(13)滴加蛋白阻斷劑(0.25%酪蛋白)，以阻斷CSA試劑的非特異性結(jié)合位點(diǎn)，10min，不洗;如用熒光素標(biāo)記酪胺需用TBST洗3次。

　　(14)用生物素標(biāo)記酪胺孵育15rain;如用熒光素標(biāo)記酪胺孵育15～30rain。溫?zé)?35~C)TBST洗3X3min。

　　(15)鏈霉親和素—HRP 37~C孵育15rain或HRP標(biāo)記的抗FITC抗體孵育30rain，溫的(35℃)TBST洗3X3min。

　　(16)0.04%DAB(含0.03%Hz02)顯色5～10min。

　　(17)復(fù)染、脫水、常規(guī)樹膠封固和結(jié)果觀察。