一、原理

　　質(zhì)粒DNA粘附在細(xì)菌細(xì)胞表面，經(jīng)過(guò)42°C短時(shí)間的熱擊處理，促進(jìn)吸收DNA.然后在非選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)一代，待質(zhì)粒上所帶的抗菌素基因表達(dá)，就可以在含抗菌素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

　　二、器材

　　旋渦混合器，微量移液取樣器，移液器吸頭，1.5ml 微量離心管，雙面微量離心管架，干式恒溫氣浴(或恒溫水浴鍋)，制冰機(jī)，恒溫?fù)u床，培養(yǎng)皿(已鋪好固體LB-Amp)，超凈工作臺(tái)，酒精燈，玻璃涂棒，恒溫培養(yǎng)箱。

　　三、試劑

　　培養(yǎng)基(不加抗菌素)，LB培養(yǎng)基(加抗菌素)，無(wú)菌ddH2O,IPTG,X-gal.

　　四、實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

　　無(wú)菌ddH2O，1.5ml離心管裝入鋁制飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應(yīng)的吸頭盒(滅菌)，20%IPTG(M/V)，2% X-gal(M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配)。

　　五、操作步驟

　　(1)事先將恒溫水浴的溫度調(diào)到42℃。

　　(2)從-70℃ 超低溫冰柜中取出一管(100μl)感受態(tài)菌，立即用手指加溫融化后插入冰上，冰浴5~10min。

　　(3) 加入5μl連接好的質(zhì)�；旌弦�(DNA含量不超過(guò)100ng)，輕輕震蕩后放置冰上20min。

　　(4) 輕輕搖勻后插入42℃水浴中1~2min進(jìn)行熱休克，然后迅速放回冰中，靜置3~5min。

　　(5) 在超凈工作臺(tái)中向上述各管中分別加入500μl LB培養(yǎng)基(不含抗菌素)輕輕混勻，然后固定到搖床的彈簧架上37℃震蕩1h.

　　(6) 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液100~300μl，分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養(yǎng)皿中，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻(注意：玻璃涂布棒上的酒精熄滅后稍等片刻，待其冷卻后再涂)。

　　(7) 如果載體和宿主菌適合藍(lán)白斑篩選的話(huà)，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精燈燒過(guò)的玻璃涂布棒涂布均勻。

　　(8) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記，先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后，再倒置過(guò)來(lái)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。

　　(9) 在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇，擦干桌面，寫(xiě)實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

　　(10)觀(guān)察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆，以菌落之間能互相分開(kāi)為好。注意白色菌斑。