原位雜交實(shí)驗(yàn)步驟

　　一質(zhì)粒制備

　　1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增

　　1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細(xì)菌

　　1. 取400uL XL1-Blue菌種加入到含200ml LB培養(yǎng)基的錐形瓶中，37 ℃、100

　　rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1 mol/L CaCl_2重懸細(xì)菌，冰浴30 min，

　　離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重懸細(xì)菌，分裝(200 μ/tube)，-80 ℃保存。

　　2. 轉(zhuǎn)化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng/μ1的質(zhì)粒DNA4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。

　　3. 輕輕搖勻，冰浴30 min。

　　4.42 ℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2 min。

　　5. 加入LB培養(yǎng)液(無(wú)氨芐青霉素)0.8ml，在37 ℃，100轉(zhuǎn)/min水浴孵育60 min。

　　6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的

　　LB-氨芐青霉素50 mg/ml,1μl/ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37 ℃培養(yǎng)12-16h。

　　1.2鑒定和挑選含重組質(zhì)粒的菌落

　　1. 用無(wú)菌牙簽挑取單菌落，接種到10 ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)2h，取1 ml之一Eppendorf離心管，加50μl10mmol/L EDTA(pH 8.0)。

　　2. 加入50μl新配置的0.2mol/L NaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振蕩3O秒。

　　3. 在70 ℃溫育5 min，然后冷卻到室溫。

　　4. 加1.5μ14mol/L KCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。

　　5. 12000g，4 ℃離以 3 min，以除去細(xì)菌碎片。

　　6. 制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNA Marker。恒壓50V，進(jìn)行電泳。

　　7. 當(dāng)溴酚蘭遷移到凝膠全長(zhǎng)的2/3-3/4時(shí)，停止電泳，在紫外燈下檢查質(zhì)粒DNA分于量的大小是否與轉(zhuǎn)入質(zhì)粒相符。

　　1.3質(zhì)粒的擴(kuò)增和純化

　　1. 用無(wú)菌牙簽分別挑取單個(gè)白色菌落移入含30ml LB-氨芐青霉素(50μg/ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37 ℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)3h。

　　2. 將菌液轉(zhuǎn)入含70 ml LB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37 ℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)過(guò)夜(12-16h)，細(xì)菌渾濁。

　　3. 菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170 μ/ml)。37 ℃，200轉(zhuǎn)/分培養(yǎng)12-16h。

　　4. 將培養(yǎng)的細(xì)菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4 ℃離,th,15 min，沉淀細(xì)菌。

　　5. 棄凈上清夜，用2ml預(yù)冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5 min

　　6. 加入新配制的溶液II 4ml，快速用手晃動(dòng)10秒，顛倒數(shù)次后，于室溫靜置10 min。

　　7. 加入預(yù)冷的溶液III 3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10 min，出現(xiàn)白色絮狀沉淀。

　　8. 6000rpm，4 ℃離心15 min，保留上清。

　　9. 將上清(若帶細(xì)菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入O.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10 min。(或-20 ℃4h，或4 ℃過(guò)夜，可便核酸沉淀)

　　10.12000 rpm，4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。

　　11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

　　12.用500μl TE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉(zhuǎn)移至1.5 ml Eppendorf管中。

　　13.加入用冰預(yù)冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000 rpm，4 ℃離心15 min，以沉淀高分子量的RNA。

　　14.將上清轉(zhuǎn)移到另一1.5 ml Eppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。

　　15.12000 rpm,4 ℃離心15 min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。

　　16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000 rpm離心，15 min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使最后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

　　17.400μl含無(wú)DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉(zhuǎn)移到另-1.5 ml Eppendorf管中，室溫放置1.5ml Eppendorf管中30min。

　　18.加入400μl 13%(v/v)的PEG 8000-NaCl(1.6 mol/L)，混勻，4 ℃ 12000rpm離心5 min以回收質(zhì)粒DNA，棄去上清。

　　19.加入400μl TE緩沖液(pH 8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris飽和酚、酚：氯仿：異戊醇(25：24：1)、和氯仿各抽提一次。

　　20.將水相(上清)移入另一1.5ml Eppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH 5.2)和2倍體積(大約1 ml)的無(wú)水乙醇，充分混勻后于4℃放置30 min。

　　21.于4 ℃ 12000 rpm離心5 min回收沉淀的質(zhì)粒DNA。盡可能棄去上清，敞開(kāi)管口，置工作臺(tái)上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

　　22.加入400 μl處于4 ℃的70%乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4 ℃ 12000 rpm離心2 min。

　　23.吸去上清，室溫敞開(kāi)管口，直到乙醇完全揮發(fā)。

　　24.用100μl TE緩沖液(pH 8.0)溶解沉淀。

　　25.取4μl溶液1：100稀釋后，測(cè)定其OD260、OD280，以確定質(zhì)粒DNA的純度和濃度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280對(duì)DNA而言其值大約為

　　1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質(zhì)污染。;DNA濃度=OD260 X 0.05 X稀釋倍數(shù)(μg/μl)。

　　26.質(zhì)粒DNA溶液于-20 ℃保存待用。

　　二、cRNA探針的標(biāo)記

　　1. 將質(zhì)粒DNA，用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶線性化，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳以確保完全線性化。

　　2. 線性化后的DNA按“質(zhì)粒的純化”步驟19-24進(jìn)行純化，作為cRNA探針標(biāo)記的模板，用相應(yīng)的RNA聚合酶合成地高辛標(biāo)記的反義和正義RNA探針。

　　3. 進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，步驟如下：

　　4. 在冰上將各試劑加入一1.5 ml無(wú)RNA酶的Eppendorf管中。DEPC處理的三蒸水8μl質(zhì)粒DNA模板 0.05μg/μl

　　1μl10 x NTP地高辛標(biāo)記混合物 1 x

　　2μl0.1 M DTT溶液 10 mM

　　2μl5 x轉(zhuǎn)錄緩沖液 1 x

　　4μlRNAse抑制劑 2U/μl

　　1μlRNA聚合酶 2U/μl

　　2μl反應(yīng)體系總體積 20μl

　　5. 加入上述各試劑后，混勻，簡(jiǎn)短離心后在37 ℃孵育2h。

　　6. 加入2μl無(wú)RNA酶的DNA酶I(10U/μ1)，37 ℃孵育15 min降解模板DNA。

　　7. 加入0.2M EDTA(pH 8.0)溶液2μl終止反應(yīng)。

　　8. 加入2.5μl的4 M Licl和7.5μl冷的無(wú)水乙醇，混勻，-20 ℃放置2h。

　　9. 12000g下離以 15 min，棄上清，小心地用50 μl冷的70%乙醇洗滌沉淀。

　　1O.室溫下稍干燥，溶于100μ1 DEPC處理過(guò)的三蒸水中，混勻分裝，-20 ℃下保持備用。

　　三、原位雜交

　　3.1冰凍切片與雜交前預(yù)處理

　　1. 將子宮樣品從-80 ℃取出，用OCT包埋，在-23 ℃(切片機(jī)腔體溫度)平衡至少30 min。將包埋好的樣品固定在樣品頭上，切10μm厚的連續(xù)組織切片，平鋪于涂有多聚賴氨酸(1mg/m1)的玻片上(玻片預(yù)先經(jīng)180 ℃干烤6小時(shí))，保存于-70 ℃冰柜備用。

　　2. 冰凍切片經(jīng)室溫干燥10 min后，在4%的多聚甲醛-PBS(pH 7.4)固定lOmin

　　3. 活躍的DEPC-PBS(未高壓的0.1%DEPC-1XPBS溶液)洗2次，每次5 min。

　　4. 在0.2M的鹽酸作用中作用10 min后，重復(fù)步驟4)。

　　5. 在切片上滴加蛋白酶K(0.1μg/m1)，37 ℃孵育15 min，重復(fù)步驟4)。

　　6. 經(jīng)0.1M TEA(三乙醇胺)作用5min后，再在新配制的0.25%AA/0.1M TEA(乙酸酐/三乙醇胺，pH 8.0)中乙酰化10 min。(在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)中，步驟4，5，6省略)

　　7. 5 x SSC中平衡15 min。

　　3.2雜交

　　8. 在脫水后的玻片上滴加預(yù)雜交液(約100 μl/玻片)，置于放有濕盒液(50%甲酰胺v/v;0.3 M NaCl;1Mm EDTA;10 mM Tris-Cl，pH 8.O)的濕盒中，55～58 ℃下的烘箱中預(yù)雜交2 h。

　　9. 甩掉預(yù)雜交液，地高辛標(biāo)記的反義或正義cRNA探針(濃度1-2ng/μl)經(jīng)70 ℃變性1O分鐘，置冰上1 min，玻片上滴加預(yù)雜交液(約60μl/玻片)，覆蓋parafilm膜，放濕盒中在48～58 ℃下雜交18-30 h。

　　3.3雜交后處理

　　1O.取出玻片，小心去掉Parafilm膜，甩掉雜交液，用52 ℃預(yù)熱的5×SSC洗30 min。

　　11.在無(wú)DNA的RNA酶A(20μg/ml)溶液中37 ℃下孵育30 min。

　　12.分別依次用52 ℃預(yù)熱的2 X SSC，1 X SSC和O.1 X SSC洗2次，每次30 min。

　　3.4雜交信號(hào)檢測(cè)

　　13.在緩沖液A(0.1M Tris-HC 1 pH 7.5，0.15M NaC1)中平衡5min。

　　14.在玻片上滴加堿性磷酸酶的抗地高辛抗體(1：500～1:2000稀釋于含0.5%阻斷液的緩沖液A中)，室溫反應(yīng)2h。

　　15.用緩沖液A洗2次，每次15 min。

　　16.在緩沖液B(0.1M Tris-HCl;0.1M NaCl;0.05M MgCl_2，pH 9.5)中平衡5min。

　　17.硝基四氮唑藍(lán)(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚氧磷酸鹽(BCIP)溶于緩沖液B中，每ml緩沖液B含有4.5μ1 NBT和3.5μ1 BCIP。在玻片上滴加混合染液在濕盒中顯色過(guò)夜。

　　18.充分顯色后，用EDTA(1 mM EDTA，pH 8.0)洗15 min終止反應(yīng)。

　　19.在95%乙醇中洗l h以除去非特異的背景。

　　20.用蒸餾水洗15 min除去可能存在的結(jié)晶體。

　　21.脫水、透明，用中性樹(shù)膠封片。

　　22.充分干燥后在顯微鏡下觀察、照相。