三、Folin—酚試劑法(Lowry法)

　　(一)實(shí)驗(yàn)原理

　　這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難(現(xiàn)在已可以訂購(gòu))，近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：?在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。?Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色(鉬蘭和鎢蘭的混合物)。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。

　　Folin—酚試劑法最早由Lowry確定了蛋白質(zhì)濃度測(cè)定的基本步驟。以后在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。這個(gè)測(cè)定法的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素(0.5%)，硫酸納(1%)，硝酸納(1%)，三錄乙酸(0.5%)，乙醇(5%)，乙迷(5%)，丙酮(0.5%)等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。

　　進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加F olin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑 被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。

　　此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。

　　此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。

　　(二)試劑與器材

　　1.試劑

　　(1)試劑甲：

　　(A) 10克 Na2CO3，2克 NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸餾水中。

　　(B) 0.5克硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份(A)與1份(B)混合，即為試劑甲。

　　(2)試劑乙：

　　在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O),25克鉬酸鈉(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克 硫 酸 鋰(Li2SO4)，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色(如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟)。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋，約加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。

　　(3)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:

　　精確稱取結(jié)晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。

　　2. 器材

　　(1)可見(jiàn)光分光光度計(jì)

　　(2)旋渦混合器

　　(3)秒表

　　(4)試管16支

　　(三)操作方法

　　1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(濃度為250mg/ml)。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫(20～25℃)放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙(Folin—酚試劑)，同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

　　注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。

　　進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，每位學(xué)生都必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量(微克)和測(cè)得的吸光度值。

　　2. 樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液(其中約含蛋白質(zhì)20~250微克)，按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。

　　根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。

　　注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度(相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì))。