蛋白激酶將磷酸基團(tuán)從ATP轉(zhuǎn)移到蛋白多肽底物上的絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基，直接影響目標(biāo)的活性和功能。放射性研究表明，真核細(xì)胞中大約30%的蛋白經(jīng)過磷酸化修飾。這一關(guān)鍵的翻譯后修飾調(diào)控了廣泛的細(xì)胞活性，包括細(xì)胞周期、分化、代謝和神經(jīng)元通訊。此外，異常的磷酸化事件與許多疾病狀態(tài)相關(guān)。在評(píng)估磷酸化時(shí)，選擇的方法可能會(huì)有所不同，這取決于多個(gè)因素，包括提出的具體問題以及特殊儀器或試劑的可用性。如何檢測蛋白磷酸化，本文簡要介紹了幾種常用方法，并提出了每種方法的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)。

　　激酶活性分析

　　蛋白激酶通常是多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了眾多負(fù)責(zé)生物反應(yīng)的下游效應(yīng)物，因此，評(píng)估某個(gè)特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報(bào)告系統(tǒng)來評(píng)估特定激酶對(duì)底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。此外，R&D Systems還提供非放射性的Universal Kinase Activity Kit，能夠定量任何可產(chǎn)生ADP的激酶的活性。盡管我們能夠獲得有關(guān)特定激酶行為的信息，但評(píng)估細(xì)胞提取物中的酶活性僅僅揭開了信號(hào)通路的冰山一角。我們對(duì)蛋白如何被修飾還知之甚少，且體外活性分析也不能說明內(nèi)源磷酸酶活性的潛在作用。磷酸化蛋白的直接檢測可能為細(xì)胞如何應(yīng)對(duì)外界刺激提供更詳細(xì)的分析，因?yàn)榱姿峄亩蔚蔫b定為蛋白的表達(dá)和功能狀態(tài)提供信息。

　　磷酸化特異抗體的開發(fā)

　　直接測定蛋白磷酸化的一種經(jīng)典方法是將整個(gè)細(xì)胞與放射性標(biāo)記的32P-磷酸鹽共同孵育，獲得細(xì)胞提取物，通過SDS-PAGE分離，并曝光在膠片上。這種繁瑣的方法需要多次幾小時(shí)的孵育，且使用放射性同位素。其他傳統(tǒng)方法包括2D凝膠電泳，這種技術(shù)假定磷酸化會(huì)改變蛋白的遷移率和等電點(diǎn)。

　　鑒于這些方法很費(fèi)力，磷酸化依賴抗體的開發(fā)受到研究人員的極大歡迎。1981年，第一個(gè)有記錄的磷酸化抗體在兔子中產(chǎn)生，使用的是鑰孔蟲戚血藍(lán)蛋白(KLH)的苯甲酰磷酸結(jié)合物。這一抗體廣泛地識(shí)別了包含磷酸酪氨酸的蛋白。十年后，利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發(fā)出多個(gè)磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標(biāo)蛋白磷酸化位點(diǎn)周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進(jìn)以及新的免疫分析技術(shù)的開發(fā)打開了大門。在任何技術(shù)中使用磷酸化特異抗體的忠告是，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。

　　Western blot是評(píng)估蛋白磷酸化狀態(tài)的最常用方法，大部分細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室都擁有開展這些實(shí)驗(yàn)的設(shè)備。利用SDS-PAGE分離生物樣品，隨后轉(zhuǎn)移到膜上(通常是PVDF或尼龍膜)，之后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Western blot實(shí)驗(yàn)步驟避免了使用放射性同位素時(shí)的危險(xiǎn)品和廢物處理要求。許多磷酸化特異抗體十分靈敏，可輕松檢測常規(guī)樣品(如10-30 µg細(xì)胞提取物)中的磷酸化蛋白。由于測得的磷酸化蛋白水平可能隨處理或凝膠上樣誤差而變化，研究人員常常利用一個(gè)抗體來檢測同源蛋白的總水平(而不考慮磷酸化狀態(tài))，以確定磷酸化組分相對(duì)于總組分的比例，并充當(dāng)上樣內(nèi)對(duì)照�；瘜W(xué)發(fā)光和顯色法都很常用，而分子量marker常用來提供蛋白分子量的信息。

　　酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)

　　ELISA已逐漸成為測定蛋白磷酸化的一種有力方法。ELISA的定量能力優(yōu)于Western blot，且在調(diào)節(jié)激酶活性和功能的研究中表現(xiàn)出巨大的作用。這種微孔板形式的分析一般利用目的蛋白特異的捕獲抗體，與磷酸化狀態(tài)無關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，目的蛋白可以是純的，也可以是復(fù)雜的異質(zhì)樣品(如細(xì)胞裂解液)中的一個(gè)組分。加入待分析的磷酸化位點(diǎn)特異的檢測抗體。這些分析通常設(shè)計(jì)為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度與最初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。與更為傳統(tǒng)的免疫印跡相比，磷酸化特異的ELISA技術(shù)具有一些優(yōu)點(diǎn)。首先，利用經(jīng)過校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)品，可輕松定量結(jié)果。其次，以三明治形式使用目的蛋白特異的兩個(gè)抗體，帶來了高的特異性。第三，ELISA的靈敏度更高允許使用更少量樣品，檢測低豐度的蛋白。最后，微孔板形式的通量比傳統(tǒng)的Western blotting要高得多。ELISA通常帶來了激酶活性的間接測定。不過，另一類ELISA技術(shù)使用固定化的捕獲抗體、底物和磷酸化底物的檢測方法，帶來激酶活性的更直接測定。