在設(shè)計IHC/ICC實驗時，一抗的選擇是相當(dāng)重要的。IHC/ICC實驗的所有步驟都必須經(jīng)過優(yōu)化，以便觀察到特異染色，并盡可能減少非特異的背景染色。這包括開展預(yù)實驗，以確定每個一抗的適當(dāng)孵育條件�？乖H和純化的多克隆抗體的稀釋度通常低于單克隆抗體，但這些值必須根據(jù)經(jīng)驗確定。為了獲得可靠特異的信號，應(yīng)采用交叉反應(yīng)性極少的高質(zhì)量抗體。

　　一抗孵育的起始條件

　　單克隆抗體多克隆抗體

　　組織5-25 µg/mL，4 °C孵育過夜1.7-15 µg/mL，4 °C孵育過夜

　　細胞5-25 µg/mL，室溫下1小時1.7-15 µg/mL，室溫下1小時

　　優(yōu)勢 單表位特異性所需濃度較低

　　限制 易受表位遮蔽的影響異質(zhì)群體

　　選擇一抗供應(yīng)商

　　在搜索一抗時，產(chǎn)品很可能有幾個不同的商業(yè)來源，而它們的抗體質(zhì)量可能參差不齊。最初的選擇也許決定了這是個成功的實驗，抑或是個錯失的機會。第一步是尋找獨立驗證。這包括在文獻中檢查抗體過去是否成功使用。許多供應(yīng)商(包括R&D Systems)都可以為尋找這一信息的研究人員提供協(xié)助。另一個問題是詢問抗體是否真的由供應(yīng)商制造，還是它采購了之后轉(zhuǎn)售?直接購買確保了商業(yè)來源對制造、質(zhì)量控制流程、以及運輸和儲存條件的完全控制。此外，一旦抗體的使用出現(xiàn)問題，制造商會處于提供優(yōu)質(zhì)技術(shù)服務(wù)的最佳地位。

　　選擇單克隆還是多克隆抗體

　　單克隆和多克隆抗體的內(nèi)在特征決定了它們用于IHC/ICC時的優(yōu)勢和限制。單克隆抗體由單個B細胞克隆產(chǎn)生，代表了同質(zhì)群體，能夠高親和力高特異性地與單個表位結(jié)合。這在檢測蛋白家族的某個成員時特別有用，因為蛋白家族有著高比例的氨基酸同源性。

　　抗體結(jié)合往往依賴于目標(biāo)蛋白維持其天然的構(gòu)想狀態(tài)。與其他蛋白的相互作用、翻譯后修飾、溫度、pH、固定和鹽濃度都會影響抗體接近目的表位。多克隆抗體是異質(zhì)的，可識別多個表位，因此它們較少受到蛋白構(gòu)象變化的影響。一般而言，多克隆抗體在一定pH和鹽濃度范圍內(nèi)也比單克隆抗體更為穩(wěn)定�；谶@些原因，多克隆抗體更常用于IHC/ICC實驗。

　　多克隆抗體的親和純化

　　多克隆抗血清是抗體混合物，它們由大量B細胞克隆產(chǎn)生。組成多克隆抗血清的抗體以不同的特異性和親和力與目標(biāo)表位結(jié)合，也與不相關(guān)的目標(biāo)分子交叉反應(yīng)(非特異相互作用)。為了富集與目的抗原特異性和親和力最高的抗體，R&D Systems的多克隆抗體經(jīng)過抗原親和純化。在此過程中，多克隆抗血清流過包含固定化抗原分子的親和柱。特異抗體被固定化抗原保留，而非特異抗體流過柱子，被丟棄。隨后從柱子上洗脫經(jīng)抗原親和純化的抗體�？乖H和純化的抗體主要與目的抗原相互作用，降低了背景染色，與未純化抗體相比產(chǎn)生了更一致的結(jié)果。

　　一抗孵育的優(yōu)化

　　一抗?jié)舛�、稀釋液、孵育時間和溫度都影響了染色質(zhì)量。這些變量需要針對每個抗體和樣品來優(yōu)化，以便實現(xiàn)特異染色和低背景。優(yōu)化通常是保持孵育時間和溫度不變，而改變抗體濃度，以確定何時獲得最佳信號和低背景噪音。例如，如果使用高親和力的抗體，那么相對較高的濃度可能需要較短的孵育時間。相反，較低的抗體濃度可能需要較長的孵育時間。人們通常采用較長的孵育時間，以確�？贵w完全滲透到體視學(xué)技術(shù)所用的組織切片。為了促進特異染色，較長時間的孵育通常在低溫下開展(即4 °C vs 室溫)。

　　R&D Systems組織切片染色方案的優(yōu)化通常是從一抗在4 °C孵育過夜開始的。對于細胞染色，人們通常選擇在室溫下與一抗共同孵育1小時�？乖H和純化過的多克隆抗體的工作濃度(1.7-15 µg/mL)通常比單克隆抗體(5-25 µg/mL)要低。在比較不同濃度的相同抗體染色的樣品時，在孵育步驟時必須使用一致的時間和濃度。當(dāng)?shù)谝淮问褂眯驴贵w時，建議開展預(yù)實驗，檢驗各種抗體濃度。