1　原理

　　蛋白酶對(duì)酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。磷鎢酸和磷鉬酸混合試劑，即福林-酚試劑，堿性條件下極不穩(wěn)定，易被酚類化合物還原而呈藍(lán)色反應(yīng)(鎢蘭和鎢蘭混合物)。由于蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，因此，蛋白質(zhì)及其水解產(chǎn)物也呈此反應(yīng)。利用蛋白酶分解酪素(底物)生成含酚基氨基酸的呈色反應(yīng)，來間接測(cè)定蛋白酶的活力。

　　2　儀器和設(shè)備

　　2.1　分析天平：精度0.0001g

　　2.2　恒溫水�。壕取�0.2℃

　　2.3　計(jì)時(shí)表

　　2.4　分光光度計(jì)

　　2.5　沸水浴器

　　2.6　振蕩混合器

　　2.7　pH計(jì): 精度0.01pH單位

　　3　試劑和溶液

　　3.1　乳酸緩沖液(pH=3.0)適用于酸性蛋白酶

　　甲液：稱取乳酸(80%-90%)10.6g,加水溶解并定容至1000ml。

　　乙液：稱取乳酸鈉(70%)16g,加水溶解并定容至1000ml.

　　使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,搖勻，稀釋一倍，即成0.05mol/L乳酸緩沖溶液。

　　3.2　磷酸緩沖液的制備(pH=7.5)適用于中性蛋白酶

　　準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鈉(Na2HPO3.12H2O)6.02和磷酸二氫鈉(NaH2PO3.2H2O)0.5g,加水定容至1000ml

　　3.3　硼酸緩沖液(pH=10.5) 適用于堿性蛋白酶

　　甲液：稱取硼酸鈉19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

　　乙液： 稱取氫氧化鈉4.0g,加水溶解并定容至1000ml.

　　使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,搖勻，用水稀釋至1L。

　　3.4　0.4mol/L碳酸鈉溶液：

　　準(zhǔn)確稱取無水碳酸鈉42.4g,以蒸餾水溶解定溶至1000ml.

　　3.5　0.4mol/L的三氯醋酸液：

　　準(zhǔn)確稱取65.4三氯醋酸,以蒸餾水溶解定溶至1000ml

　　3.6　0.5mol/L的NaOH：

　　準(zhǔn)確稱取2g NaOH溶解并定至100ml

　　3.7　10.00mg/ml酪素溶液

　　稱取酪素1.000g,準(zhǔn)確至0.001g,用少量的0.5mol/L的氫氧化鈉溶液(若為酸性蛋白酶則用濃乳酸2-3滴)潤(rùn)濕,,加入適量的各適宜的緩沖液約80ml,在沸水浴中邊加熱邊攪拌,直至完全溶解,冷卻后,轉(zhuǎn)入100ml容量瓶中,用適宜的緩沖液稀釋至刻度,此溶液在冰箱內(nèi)貯存,有效期為三天.

　　3.8　100μg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液

　　3.8.1準(zhǔn)確稱取預(yù)先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L的鹽酸60ml 溶解后定容至100ml,即為1.00mg/ml的酪氨酸溶液.

　　3.8.2吸取1.00mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00ml,用0.1mol/L鹽酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液.

　　3.9　酶樣的制備

　　準(zhǔn)確稱取1.000g固體酶或移取1ml液體酶樣，用少量的適宜緩沖液溶解并用玻璃棒搗研,然后將上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量緩沖液搗研多次,最后全部移入容量瓶,稀釋到刻度,用四層紗布過濾。濾液可作為測(cè)試酶用.該酶已經(jīng)稀釋100倍。

　　4　分析步驟

　　4.1　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

　　L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液按下表配制。

　　試管號(hào) 0 1 2 3 4 5

　　取 100 μ g/ml 酪氨溶液( ml ) 0 1 2 3 4 5

　　蒸餾水( ml ) 10 9 8 7 6 5

　　酪氨酸實(shí)際濃度(μ g/ml ) 0 10 20 30 40 50

　　4.2　分別取上述溶液各1.00ml(須做平行試驗(yàn))，各加0.4mol/L碳酸鈉溶液5.00ml。福林試劑使用溶液1.00ml,置于40+0.2℃水浴中顯色20min,取出用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680nm,比色，以不含酪氨酸的0管為空白管調(diào)零點(diǎn)，分別測(cè)定其吸光度值，以吸光度值為縱坐標(biāo)，酪氨酸的濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線或計(jì)算回歸方程。計(jì)算出當(dāng)OD為1時(shí)的酪氨酸的量(μg)，即為吸光常數(shù)K值，其K值應(yīng)在95~100范圍內(nèi)。

　　4.3　樣品測(cè)定：

　　4.3.1先將酪素溶液放入40±0.2℃恒溫水浴中，預(yù)熱5min

　　4.3.2取4支試管，各加入1ml酶液

　　4.3.3取一支作為空白管，加2ml三Chloroacetic acid，其他3管作為測(cè)試管各加入1ml酪素，搖勻，40℃保溫10min

　　4.3.4取出試管，3支測(cè)試管中各加入2ml三Chloroacetic acid，空白管中加1ml酪素。

　　4.3.5靜置10min，過濾沉淀

　　4.3.5各取1ml濾液，分別加0.4mol/L的 Na2CO3 5ml、福林試劑1ml。在40℃顯色20min。680nm處測(cè)OD值。以空白管調(diào)零點(diǎn)。

　　注：1.398中性蛋白酶制劑和166中性蛋白酸制劑，除反應(yīng)與顯色溫度為30℃±0.2℃外，其他操作同上，標(biāo)準(zhǔn)曲線做同樣處理。

　　5. 計(jì)算

　　5.1 酶活定義：

　　1g固體酶粉(或1ml液體酶)，在40℃(酸性pH=3.0、中性pH=7.5、堿性pH=10.5)條件下，1min水解酪素產(chǎn)生1μg酪氨酸為一個(gè)酶活力單位。

　　5.2 計(jì)算酶的活性單位依據(jù)以下公式

　　蛋白酶的活力= A×K×4/10×n U/g(ml)

　　A：樣品平行試驗(yàn)的平均OD值

　　K：吸光常數(shù)

　　4：反應(yīng)試劑的總體積

　　10：酶解反應(yīng)時(shí)間

　　n：酶液稀釋總倍數(shù)