1.探針的標(biāo)記

　　(1) 如下設(shè)置探針標(biāo)記的反應(yīng)體系：

　　待標(biāo)記探針 (1.75pmol/微升) 2微升

　　T4 Polynucleotide Kinase Buffer (10X) 1微升

　　Nuclease-Free Water 5微升

　　[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmol at 10mCi/ml) 1微升

　　T4 Polynucleotide Kinase (5-10U/微升) 1微升

　　總體積 10微升

　　按照上述反應(yīng)體系依次加入各種試劑,加入同位素后,Vortex混勻,再加入T4 Polynucleotide Kinase,混勻.

　　(2) 使用水浴或PCR儀,37℃反應(yīng)10分鐘.

　　(3) 加入1微升探針標(biāo)記終止液,混勻,終止探針標(biāo)記反應(yīng).

　　(4) 再加入89微升TE,混勻.此時可以取少量探針用于檢測標(biāo)記的效率.通常標(biāo)記的效率在30%以上,即總放射性的30%以上標(biāo) 記到了探針上.為實驗簡便起見,通常不必測定探針的標(biāo)記效率.

　　(5) 標(biāo)記好的探針最好立即使用,最長使用時間一般不宜超過3天.標(biāo)記好的探針可以保存在-20℃.

　　2.探針的純化

　　通常為實驗簡便起見,可以不必純化標(biāo)記好的探針.在有些時候,純化后的探針會改善EMSA的電泳結(jié)果.如需純化,可以按照如 下步驟操作：

　　(1) 對于100微升標(biāo)記好的探針,加入1/4體積即25微升的5M醋酸銨,再加入2體積即200微升的無水乙醇,混勻.

　　(2) 在-70℃至-80℃沉淀1小時,或在-20℃沉淀過夜.

　　(3) 在4℃,12000g-16000g離心30分鐘.小心去除上清,切不可觸及沉.

　　(4) 在4℃,12000g-16000g離心1分鐘.小心吸去殘余液體.微晾干沉淀,但不宜過分干燥.

　　(5) 加入100微升TE,完全溶解沉淀.標(biāo)記好的探針最好立即使用,最長使用時間一般不宜超過3天.標(biāo)記好的探針可以保存于-20℃.

　　3.EMSA膠的配制

　　(1) 準(zhǔn)備好倒膠的模具.可以使用常規(guī)的灌制蛋白電泳膠的模具,或其它適當(dāng)?shù)哪＞?最好選擇可以灌制較薄膠的模具,以便于干膠等后續(xù)操作.為得到更好的結(jié)果,可以選擇可灌制較大 EMSA 膠的模具.

　　(2) 按照如下配方配制20毫升4%的聚丙烯酰胺凝膠(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis對結(jié)果影響不大).

　　TBE buffer (10X) 1毫升

　　重蒸水 16.2毫升

　　39:1 acrylamide/bisacrylamide (40%,w/v) 2毫升

　　80% 甘油 625微升

　　10% 過硫酸銨 (ammonium persulfate) 150微升

　　TEMED 10微升

　　(3) 按照上述次序加入各個溶液,加入TEMED前先混勻,加入TEMED后立即混勻,并馬上加入到制膠的模具中.避免產(chǎn)生氣泡, 并加上梳齒.如果發(fā)現(xiàn)非常容易形成氣泡,可以把一塊制膠的玻璃板進行硅烷化處理.

　　4.EMSA結(jié)合反應(yīng)

　　(1) 如下設(shè)置EMSA結(jié)合反應(yīng)：

　　陰性對照反應(yīng)：

　　Nuclease-Free Water 7微升

　　EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升

　　細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 0微升

　　標(biāo)記好的探針 1微升

　　總體積 10微升

　　樣品反應(yīng)：

　　Nuclease-Free Water 5微升

　　EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升

　　細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升

　　標(biāo)記好的探針 1微升

　　總體積 10微升

　　探針冷競爭反應(yīng)：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升

　　細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升

　　未標(biāo)記的探針 1微升

　　標(biāo)記好的探針 1微升

　　總體積 10微升

　　突變探針的冷競爭反應(yīng)：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升

　　細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升

　　未標(biāo)記的突變探針 1微升

　　標(biāo)記好的探針 1微升

　　總體積 10微升

　　Super-shift反應(yīng)：

　　Nuclease-Free Water 4微升

　　EMSA/Gel-Shift結(jié)合緩沖液(5X) 2微升

　　細(xì)胞核蛋白或純化的轉(zhuǎn)錄因子 2微升

　　目的蛋白特異抗體 1微升

　　標(biāo)記好的探針 1微升

　　總體積 10微升

　　(2) 按照上述順序依次加入各種試劑 ,在加入標(biāo)記好的探針前先混勻,并且室溫(20-25℃)放置10分鐘,從而消除可能發(fā)生的探針和蛋白的非特異性結(jié)合,或者讓冷探針優(yōu)先反應(yīng).然后加入標(biāo)記好的探針,混勻,室溫(20-25℃)放置20分鐘.

　　(3) 加入1微升EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(無色,10X),混勻后立即上樣.注意：有些時候溴酚藍會影響蛋白和DNA的結(jié)合,建 議盡量使用無色的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液.如果對于使用無色上樣緩沖液在上樣時感覺到無法上樣,可以在無色上樣緩沖液里面添加極少量的藍色的上樣緩沖液,至能觀察到藍顏色即可.

　　5. 電泳分析

　　(1) 用0.5XTBE作為電泳液.按照10V/厘米的電壓預(yù)電泳10分鐘.預(yù)電泳的時候如果有空余的上樣孔,可以加入少量稀釋好的1X 的EMSA上樣緩沖液(藍色),以觀察電壓是否正常進行.

　　(2) 把混合了上樣緩沖液的樣品加入到上樣孔內(nèi).在多余的某個上樣孔內(nèi)加入10微升稀釋好的1X的EMSA/Gel-Shift上樣緩沖液(藍色),用于觀察電泳進行的情況.

　　(3) 按照10V/厘米的電壓電泳.確保膠的溫度不超過30℃,如果溫度升高,需要適當(dāng)降低電壓.電泳至EMSA/Gel-Shift上樣緩 沖液中的藍色染料溴酚藍至膠的下緣1/4處,停止電泳.

　　(4) 剪一片大小和EMSA膠大小相近或略大的比較厚實的濾紙.小心取下夾有EMSA膠的膠板,用吸水紙或普通草紙大致擦干膠板邊緣的電壓液.小心打開兩塊膠板中的上面一塊(注：通常選擇先移走硅烷化的那塊玻璃板),把濾紙從EMSA膠的一側(cè)逐漸覆蓋住整個EMSA膠,輕輕把濾紙和膠壓緊.濾紙被膠微微浸濕后(大約不足1分鐘),輕輕揭起濾紙,這時EMSA膠會被濾紙一起揭起來.把濾紙側(cè)向下,放平,在EMSA膠的上面覆蓋一層保鮮膜,確保保鮮膜和膠之間沒有氣泡.

　　(5) 干膠儀器上干燥EMSA膠.然后用X光片壓片檢測,或用其它適當(dāng)儀器設(shè)備檢測.