蛋白質(zhì)定量(比色法)

　　蛋白質(zhì)通常是多種蛋白質(zhì)的化合物，比色法測(cè)定的基礎(chǔ)是蛋白質(zhì)構(gòu)成成分：氨基酸(如酪氨酸，絲氨酸)與外加的顯色基團(tuán)或者染料反應(yīng)，產(chǎn)生有色物質(zhì)。有色物質(zhì)的濃度與蛋白質(zhì)反應(yīng)的氨基酸數(shù)目直接相關(guān)，從而反應(yīng)蛋白質(zhì)濃度。

　　常用的比色方法一般有BCA，Bradford，Lowry 等幾種方法。

　　Lowry 法：

　　以最早期的Biuret 反應(yīng)為基礎(chǔ)，并有所改進(jìn)。蛋白質(zhì)與Cu2+反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色的反應(yīng)物。但是與Biuret相比，Lowry 法敏感性更高。缺點(diǎn)是需要順序加入幾種不同的反應(yīng)試劑;反應(yīng)需要的時(shí)間較長(zhǎng);容易受到非蛋白物質(zhì)的影響;含EDTA，Triton x-100，ammonia sulfate 等物質(zhì)的蛋白不適合此種方法。

　　BCA(Bicinchoninine　acid　assay)法：

　　這是一種較新的、更敏感的蛋白測(cè)試法。要分析的蛋白在堿性溶液里與Cu2+反應(yīng)產(chǎn)生Cu+，后者與BCA形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在562nm波長(zhǎng)。此化合物與蛋白濃度的線性關(guān)系極強(qiáng)，反應(yīng)后形成的化合物非常穩(wěn)定。相對(duì)于Lowry法，操作簡(jiǎn)單，敏感度高。但是與Lowry法相似的是容易受到蛋白質(zhì)之間以及去污劑的干擾。

　　Bradford 法：

　　這種方法的原理是蛋白質(zhì)與考馬斯亮蘭結(jié)合反應(yīng)，產(chǎn)生的有色化合物吸收峰595nm。其最大的特點(diǎn)是，敏感度好，是Lowry 和BCA 兩種測(cè)試方法的2 倍;操作更簡(jiǎn)單，速度更快;只需要一種反應(yīng)試劑;化合物可以穩(wěn)定1小時(shí)，方便結(jié)果;而且與一系列干擾Lowry，BCA 反應(yīng)的還原劑(如DTT，巰基乙醇)相容。但是對(duì)于去污劑依然是敏感的。最主要的缺點(diǎn)是不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。

　　某些初次接觸比色法測(cè)定的研究者可能為各種比色法測(cè)出的結(jié)果并不一致，感到迷惑，究竟該相信哪種方法?由于各種方法反應(yīng)的基團(tuán)以及顯色基團(tuán)不一，所以同時(shí)使用幾種方法對(duì)同一樣品得出的樣品濃度無可比性。例如：Keller等測(cè)試人奶中的蛋白，結(jié)果Lowry，BCA 測(cè)出的濃度明顯高于Bradford，差異顯著。即使是測(cè)定同一樣品，同一種比色法選擇的標(biāo)準(zhǔn)樣品不一致，測(cè)試后的濃度也不一致。如用Lowry測(cè)試細(xì)胞勻漿中的蛋白質(zhì)，以BSA作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度1.34mg/ml，以a球蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品，濃度2.64mg/ml。因此，在選擇比色法之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。另外，比色法定量蛋白質(zhì)，經(jīng)常出現(xiàn)的問題是樣品的吸光值太低，導(dǎo)致測(cè)出的樣品濃度與實(shí)際的濃度差距較大。關(guān)鍵問題是，反應(yīng)后1011分光光度計(jì)的重要配件—— 比色皿的顏色是有一定的半衰期，所以每種比色法都列出了反應(yīng)測(cè)試時(shí)間，所有的樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)樣品)，都必須在此時(shí)間內(nèi)測(cè)試。時(shí)間過長(zhǎng)，得到的吸光值變小，換算的濃度值降低。

　　可能存在的誤差：

　　反應(yīng)溫度、溶液PH值等都是影響實(shí)驗(yàn)的重要原因。此外，非常重要的是，最好是用塑料的比色法。避免使用石英或者玻璃材質(zhì)的比色皿，因?yàn)榉磻?yīng)后的顏色會(huì)讓石英或者玻璃著色，導(dǎo)致樣品吸光值不準(zhǔn)確。