第一章 基因克隆

　　1. 操作流程

　　收集基因信息——>設(shè)計(jì)引物——>PCR ——>回收目的片段——>與載體

　　連接，取得連接產(chǎn)物 ——> 用感受態(tài)細(xì)胞做轉(zhuǎn)化 ——>接菌——>陽(yáng)性克隆鑒

　　定(酶切法或PCR)——>質(zhì)粒抽提——>質(zhì)粒測(cè)序——>測(cè)序結(jié)果分析——>克隆

　　信息輸入數(shù)據(jù)庫(kù)——>質(zhì)粒實(shí)物保存

　　第一章 基因克隆

　　2. 方法

　　2.1 設(shè)計(jì)引物

　　引物設(shè)計(jì)要求：引物長(zhǎng)度為25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm

　　為70℃(±4℃)，且兩條引物的Tm 相差不超過(guò)4℃。引物之間及引物本身避免形

　　成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物與模板不能有任何錯(cuò)配。

　　forward primer 5’加:GGCCAATCCGGCC

　　reverse primer 5’加:GGCCTCTAAGGCC

　　2.2 PCR

　　2.2.1 PCR 反應(yīng)體系

　　模扳(100ng/ul 質(zhì)粒) 2.00μl

　　4dNTP(10mM) 1.00μl

　　10×PCR Buffer 5.00μl

　　MgCl2(25mM) 5.00μl

　　5’Primer (10-12uM) 4.00μl

　　3’Primer (10-12uM) 4.00μl

　　5M 甜菜堿 10.00μl

　　Pfu (5U/ul) 0.50μl

　　ddH20 18.50μl

　　第一章 基因克隆

　　總計(jì) 50.00μl

　　2.2.2 PCR 反應(yīng)程序

　　1)從cDNA 文庫(kù)克隆基因

　　Stage1 Stage2 Stage3

　　1 Cycle 30Cycle 1 Cycle

　　95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

　　2min 30sec 30 sec

　　Xmin(2

　　min/Kb)

　　10min 1min

　　注：Pfu 酶最適延伸溫度為68℃。

　　2)從含目的基因質(zhì)粒中克隆

　　Stage1 Stage2 Stage3

　　1 Cycle 22Cycle 1 Cycle

　　95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃

　　2min 30sec 30 sec

　　Xmin(2

　　min/Kb)

　　10min 1min

　　2.3 割膠回收目的片段

　　(QIAGEN QIAquickGel Extraction Kit)

　　1) 1%Agarose 膠電泳將目的DNA 片段用干凈的手術(shù)刀割下，放入1.5ml 離心管

　　2) 稱重后，在1.5ml 離心管中加入3 倍膠體積的buffer QG(100mg 加300ul)

　　3) 50℃水浴中放置10min(至膠完全溶解)，每2-3 分鐘混勻一次(溶膠液應(yīng)于

　　buffer QG 顏色相同)

　　4) 加入1 倍膠體積的異丙醇然后充分混勻，靜置片刻。

　　5) 將樣品轉(zhuǎn)移入柱子中(柱子的最大容量為800uL)，然后13000rpm*1min 離心

　　6) 取下柱子，棄流出液，將柱子放回到剛才那個(gè)收集管中

　　第一章 基因克隆

　　7) 加入0.75mL buffer PE 至柱子，室溫放置2-5min，然后13000rpm*1min 離心

　　8) 取下柱子，棄流出液，再次13000rpm*1min 離心

　　9) 將柱子放置在一支新的1.5mL 離心管中，加入50uL EB buffer (或無(wú)菌H2O)

　　至膜中央，靜置片刻，然后13000rpm*1min 離心，然后測(cè)定濃度

　　2.4 連 接

　　在連接反應(yīng)中通常要求： (目的基因分子數(shù)：載體分子數(shù)=3：1)

　　連接反應(yīng)體系

　　sample + -

　　10*T4 buffer 1.00μl 1.00μl 1.00μl

　　PGEM-T (50ng/ul) 1.00μl 1.00μl 1.00μl

　　目的基因(150ng/ul) 1.00μl 1.00μl /

　　T4 連接酶 0.50μl 0.50μl 0.50μl

　　補(bǔ)水 6.50μl 6.50μl 7.50μl

　　于16℃連接過(guò)夜�；蚴覝�(25℃)1 小時(shí)以上。

　　2.5 感受態(tài)細(xì)胞制備及轉(zhuǎn)化

　　2.5.1 CaCl2 制備感受態(tài)細(xì)胞(DH5α 、DH10B、TOP10 )

　　1) 接過(guò)夜菌 在15ml 試管中加入3ml LB 培養(yǎng)基，從平板上挑取一單克隆接

　　種，37℃，260rpm，培養(yǎng)過(guò)夜，約16 小時(shí)。

　　2) 接菌 取2ml 過(guò)夜菌接入200ml 新鮮的LB 培養(yǎng)基， 37℃，260rpm，培

　　養(yǎng)，直至OD600=0.4-0.5(一般約2 小時(shí)),然后將菌液冰浴30-60 分鐘。

　　3) 收菌 4℃，5000rpm×5min，棄上清。

　　4) CaCl2 懸浮 若50ml 菌液收菌，用10ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸

　　浮，冰浴10min。

　　5)離心 4℃，5000rpm×5min，棄上清。

　　第一章 基因克隆

　　6)CaCl2 懸浮 以2ml 0.1M 的CaCl2 輕輕吹打，充分懸浮，冰浴30min 即感

　　受態(tài)制備完成。

　　此時(shí)感受態(tài)可直接使用或冰浴過(guò)夜第二天使用或加入10%的滅菌甘油，混勻后

　　-80℃凍存，以后使用(一般可存1 個(gè)月)。

　　注： 制備感受態(tài)細(xì)胞要求嚴(yán)格控制溫度，制備過(guò)程在冰上操作。

　　2.5.2 轉(zhuǎn)化(PGEM-T vector)

　　1) 準(zhǔn)備1.5ml 的離心管，冰浴預(yù)冷。

　　2) 取100ul 感受態(tài)細(xì)胞，加入5ul 連接液，冰浴45-60min。

　　3) 42℃熱刺激90sec。(此關(guān)鍵步驟，一定注意溫度及時(shí)間)

　　4) 冰浴2min。

　　5) 加LB 培養(yǎng)基900ul，37℃，150rpm 培養(yǎng)45-60min。

　　6) 4000rpm×3min 離心。

　　7) 留100ul 上清，棄多余部分，混勻，涂布到含氨芐青霉素的LB 板(預(yù)先涂

　　布X-gal 和IPTG)。

　　8) 37℃ 培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)過(guò)夜，約16 小時(shí)。

　　2.6 接菌

　　1) 轉(zhuǎn)化得到藍(lán)白菌落篩選板 (因?yàn)槲覀円话阌玫氖荘GEM-T 做連接，經(jīng)X-gal

　　處理后，有插入片段的顯白色;載體自連的顯藍(lán)色，因此得到篩選。)

　　2) 挑取白色的菌落接到含氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)基。

　　3) 37℃，260rpm 培養(yǎng)。

　　4) 培養(yǎng)5-6 小時(shí)后挑取2ul 菌液為模板做PCR 鑒定。

　　5) 以PCR 結(jié)果，將有目的片段插入的樣品以5ml LB 培養(yǎng)基再次接菌，37℃，

　　260rpm 培養(yǎng)過(guò)夜，約16 小時(shí)。

　　2.7 陽(yáng)性克隆鑒定 (PCR 鑒定)

　　2.7.1PCR 鑒定體系

　　第一章 基因克隆

　　10X Taq buffer 3 ul

　　4X dNTP (10mM) 0.5 ul

　　Taq DNA polymerase(5U/ul) 0.2ul(1U)

　　10uM引物 (雙向) 各1ul

　　50%DMSO(which is optional) 1ul

　　模板：過(guò)夜菌液 / 挑單克隆 2ul

　　加滅菌水至 30ul

　　2.7.2 PCR 鑒定程序：

　　94℃ 5min

　　94℃ 30s

　　30cycle 55℃ 30s

　　72℃ 3min

　　72℃ 10min

　　4℃ +∞

　　30ul 上樣，走電泳(以100bp plus marker 為對(duì)照)→核對(duì)片斷大小

　　2.8 質(zhì)粒抽提 (質(zhì)粒小量抽提試劑盒)

　　1) 收菌 以10000 rpm ×1 min 離心收菌。(一般抽提一份用3-4ml 菌液)

　　2) 棄上清。

　　3) 加100ul 冰浴Solution I(含Rnase A)，渦旋振蕩，使菌體充分懸浮。

　　4) 加200ul Solution II，溫和混勻6 次。(此過(guò)程不超過(guò)5min)

　　5) 加280ul Solution III，溫和混勻6 次。

　　6) 以14000 rpm×10 min 離心。

　　7) 取上清，過(guò)吸附柱，以10000 rpm×1 min，棄濾液。

　　8) 吸附柱內(nèi)加450ul Buffer2，10000 rpm×1 min，棄濾液。

　　9) 反復(fù)步驟8)一次。

　　第一章 基因克隆

　　10) 14000 rpm×1 min 離心。

　　11) 將吸附柱旋轉(zhuǎn)180 度后再14000 rpm×1 min 離心。

　　12) 加40ul 50℃預(yù)熱的ddH2O(或EB buffer)于吸附柱的膜中央，室溫靜置

　　2min。

　　13) 14000 rpm×1 min 離心并收集洗脫液，即質(zhì)粒DNA。

　　2.9 測(cè) 序

　　1) ABI377 測(cè)序儀測(cè)序。

　　2) 測(cè)序結(jié)果分析：用軟件Vector NTI Suite 6 分析測(cè)序結(jié)果。每個(gè)克隆相應(yīng)的測(cè)

　　序結(jié)果，分析結(jié)果，存儲(chǔ)信息分類輸入數(shù)據(jù)庫(kù)http://192.168.0.2/index.htm。

　　克隆信息管理系統(tǒng)。將測(cè)序完成的克隆編號(hào)入庫(kù)。

　　3. 基因克隆的編碼

　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)基因引物的號(hào)碼相對(duì)應(yīng)編制。

　　如：基因引物編號(hào)： 1000_f 1000_r

　　克隆編號(hào)： 1000A1 or 100092

　　(注：號(hào)碼倒數(shù)第二位為日期編號(hào)： 1—9 為阿拉伯?dāng)?shù)字 10=A,11=B,12=C…

　　最后一位為克隆數(shù)編號(hào)，一般為1—3)