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檢測(cè)微生物生長(zhǎng)的方法

[2015/1/14]

一、生長(zhǎng)量測(cè)定法
1、體積測(cè)量法：又稱測(cè)菌絲濃度法。
    通過(guò)測(cè)定一定體積培養(yǎng)液中所含菌絲的量來(lái)反映微生物的生長(zhǎng)狀況。方法是：取一定量的待測(cè)培養(yǎng)液（如10毫升）放在有刻度的離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間（如5分鐘）和轉(zhuǎn)速（如5000 rpm），離心后，倒出上清夜，測(cè)出上清夜體積為v，則菌絲濃度為（10-v）/10。菌絲濃度測(cè)定法是大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的一個(gè)重要監(jiān)測(cè)指標(biāo)。這種方法比較粗放，簡(jiǎn)便，快速，但需要設(shè)定一致的處理?xiàng)l件，否則偏差很大，由于離心沉淀物中夾雜有一些固體營(yíng)養(yǎng)物，結(jié)果會(huì)有一定偏差。
2、稱干重發(fā)法：
    可用離心或過(guò)濾法測(cè)定。一般干重為濕重的10-20%。在離心法中，將一定體積待測(cè)培養(yǎng)液倒入離心管中，設(shè)定一定的離心時(shí)間和轉(zhuǎn)速，進(jìn)行離心，并用清水離心洗滌1-5次，進(jìn)行干燥。干燥可用烘箱在1050C或1000C下烘干，或采用紅外線烘干，也可在800C或400C下真空干燥，干燥后稱重。如用過(guò)濾法，絲狀真菌可用濾紙過(guò)濾，細(xì)菌可用醋酸纖維膜等濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后用少量水洗滌，在400C下進(jìn)行真空干燥。稱干重發(fā)法較為煩瑣，通常獲取的微生物產(chǎn)品為菌體時(shí)，常采用這種方法，如活性干酵母（ADY）,一些以微生物菌體為活性物質(zhì)的飼料和肥料。
3、比濁法：
    微生物的生長(zhǎng)引起培養(yǎng)物混濁度的增高。通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定一定波長(zhǎng)下的吸光值，判斷微生物的生長(zhǎng)狀況。對(duì)某一培養(yǎng)物內(nèi)的菌體生長(zhǎng)作定時(shí)跟蹤時(shí)，可采用一種特制的有側(cè)臂的三角燒瓶。將側(cè)臂插入光電比色計(jì)的比色座孔中，即可隨時(shí)測(cè)定其生長(zhǎng)情況，而不必取菌液。該法主要用于發(fā)酵工業(yè)菌體生長(zhǎng)監(jiān)測(cè)。如我所使用UNICO公司的紫外-可見分光光度計(jì)，在波長(zhǎng)600nm 處用比色管定時(shí)測(cè)定發(fā)酵液的吸光光度值OD600，以此監(jiān)控E.Coli的生長(zhǎng)及誘導(dǎo)時(shí)間。
4、菌絲長(zhǎng)度測(cè)量法：
   對(duì)于絲狀真菌和一些放線菌，可以在培養(yǎng)基上測(cè)定一定時(shí)間內(nèi)菌絲生長(zhǎng)的長(zhǎng)度，或是利用一只一端開口并帶有刻度的細(xì)玻璃管，到入合適的培養(yǎng)基，臥放，在開口的一端接種微生物，一段時(shí)間后記錄其菌絲生長(zhǎng)長(zhǎng)度，借此衡量絲狀微生物的生長(zhǎng)。
二、微生物計(jì)數(shù)法
1、血球計(jì)數(shù)板法:
   血球計(jì)數(shù)板是一種有特別結(jié)構(gòu)刻度和厚度的厚玻璃片，玻片上有四條溝和兩條嵴，中央有一短橫溝和兩個(gè)平臺(tái)，兩嵴的表比兩平臺(tái)的表面高0.1 mm，每個(gè)平臺(tái)上刻有不同規(guī)格的格網(wǎng)，中央0.1 mm2面積上刻有400個(gè)小方格。通過(guò)油鏡觀察，統(tǒng)計(jì)一定大格內(nèi)微生物的數(shù)量，即可算出1毫升菌液中所含的菌體數(shù)。這種方法簡(jiǎn)便，直觀，快捷，但只適宜于單細(xì)胞狀態(tài)的微生物或絲狀微生物所產(chǎn)生的孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)，并且所得結(jié)果是包括死細(xì)胞在內(nèi)的總菌數(shù)。
2、染色計(jì)數(shù)法：
   為了彌補(bǔ)一些微生物在油鏡下不易觀察計(jì)數(shù)，而直接用血球計(jì)數(shù)板法又無(wú)法區(qū)分死細(xì)胞和活細(xì)胞的不足，人們發(fā)明了染色計(jì)數(shù)法。借助不同的染料對(duì)菌體進(jìn)行適當(dāng)?shù)娜旧，可以更方便的在顯微鏡下進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。如酵母活細(xì)胞計(jì)數(shù)可用美藍(lán)染色液，染色后在顯微鏡下觀察，活細(xì)胞為無(wú)色，而死細(xì)胞為藍(lán)色。
3、比例計(jì)數(shù)法：
  將已知顆粒（如霉菌孢子或紅細(xì)胞）濃度的液體與一待測(cè)細(xì)胞濃度的菌液按一定比例均勻混合，在顯微鏡視野中數(shù)出各自的數(shù)目，即可得未知菌液的細(xì)胞濃度。這種計(jì)數(shù)方法比較粗放。并且需要配制已知顆粒濃度的懸液做標(biāo)準(zhǔn)。
4、液體稀釋法：
   對(duì)未知菌樣做連續(xù)十倍系列稀釋，根據(jù)估計(jì)數(shù)，從最適宜的三個(gè)連續(xù)的10倍稀釋液中各取5毫升試樣，接種1毫升到3組共15只裝培養(yǎng)液的試管中，經(jīng)培養(yǎng)后記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù)，然后查最大或然數(shù)表MPN（most probably number）得出菌樣的含菌數(shù)，根據(jù)樣品稀釋倍數(shù)計(jì)算出活菌含量。該法常用于食品中微生物的檢測(cè)，例如飲用水和牛奶的微生物限量檢查。
5、平板菌落計(jì)數(shù)法：
   將待測(cè)菌液進(jìn)行梯度稀釋，取一定體積的稀釋菌液與合適的固體培養(yǎng)基在凝固前均勻混合，或?qū)⒕和坎加谝涯痰墓腆w培養(yǎng)基平板上。保溫培養(yǎng)后，用平板上出現(xiàn)的菌落數(shù)乘以菌液稀釋度，即可算出原菌液的含菌數(shù)。一般以直徑9cm的平板上出現(xiàn)50-500個(gè)菌落為宜。但方法比較麻煩，操作者需有熟練的技術(shù)。平板菌落計(jì)數(shù)法不僅可以得出菌液中活菌的含菌數(shù)，而且同時(shí)將菌液中的細(xì)菌進(jìn)行了一次分離培養(yǎng)，獲得了單克隆。
6、試劑紙法：
   小型商品化產(chǎn)品以供快速計(jì)數(shù)用。形式有小型厚濾紙片，瓊脂片等。在濾紙和瓊脂片中吸有合適的培養(yǎng)基，其中加入活性指示劑2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC，無(wú)色）待蘸取測(cè)試菌液后置密封包裝袋中培養(yǎng)。短期培養(yǎng)后在濾紙上出現(xiàn)一定密度的玫瑰色微小菌落與標(biāo)準(zhǔn)紙色板上圖譜比較即可估算出樣品的含菌量。試劑紙法計(jì)數(shù)快捷準(zhǔn)確，相比而言避免了平板計(jì)數(shù)法的人為操作誤差。
7、膜過(guò)濾法：
   用特殊的濾膜過(guò)濾一定體積的含菌樣品，經(jīng)丫叮橙染色，在紫外顯微鏡下觀察細(xì)胞的熒光，活細(xì)胞會(huì)發(fā)橙色熒光，而死細(xì)胞則發(fā)綠色熒光。
三、生理指標(biāo)法
    微生物的生長(zhǎng)伴隨著一系列生理指標(biāo)發(fā)生變化，例如酸堿度，發(fā)酵液中的含氮量，含糖量，產(chǎn)氣量等，與生長(zhǎng)量相平行的生理指標(biāo)很多，它們可作為生長(zhǎng)測(cè)定的相對(duì)值。
1、測(cè)定含氮量：
   大多數(shù)細(xì)菌的含氮量為干重的12.5%，酵母為7.5%，霉菌為6.0%。根據(jù)含氮量×6.25，即可測(cè)定粗蛋白的含量。含氮量的測(cè)定方法有很多，如用硫酸，過(guò)氯酸，碘酸，磷酸等消化法和Dumas測(cè)N2氣法。Dumas測(cè)N2氣法是將樣品與CuO混合，在CO2氣流中加熱后產(chǎn)生氮?dú)，收集在呼吸?jì)中，用KOH吸去CO2后即可測(cè)出N2的量。
2、測(cè)定含碳量：
   將少量（干重0.2-2.0 mg）生物材料混入1毫升水或無(wú)機(jī)緩沖液中，用2毫升2%的K2Cr2O7溶液在100 0C下加熱30分鐘后冷卻。加水稀釋至5毫升，在580nm的波長(zhǎng)下讀取吸光光度值，即可推算出生長(zhǎng)量。需用試劑做空白對(duì)照，用標(biāo)準(zhǔn)樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3、還原糖測(cè)定法：
   還原糖通常是指單糖或寡糖，可以被微生物直接利用，通過(guò)還原糖的測(cè)定可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況，常用于大規(guī)模工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)上微生物生長(zhǎng)的常規(guī)監(jiān)測(cè)。方法是，離心發(fā)酵液，取上清液，加入斐林試劑，沸水浴煮沸3分鐘，取出加少許鹽酸酸化，加入Na2S2O3臨近終點(diǎn)時(shí)加入淀粉溶液，繼續(xù)加Na2S2O3至終點(diǎn)，查表讀出還原糖的含量。
4、氨基氮的測(cè)定：
   方法是：離心發(fā)酵液，取上清液，加入甲基紅和鹽酸作指示劑，加入0.02N的NaOH調(diào)色至顏色剛剛褪去，加入底物18%的中性甲醛，反應(yīng)數(shù)刻，加入0.02N的使之變色，根據(jù)NaOH的用量折算出氨基氮的含量。根據(jù)培養(yǎng)液中氨基氮的含量，可間接反映微生物的生長(zhǎng)狀況。
5、其他生理物質(zhì)的測(cè)定：
   P，DNA，RNA，ATP，NAM（乙酰胞壁酸）等含量以及產(chǎn)酸，產(chǎn)氣，產(chǎn)CO2（用標(biāo)記葡萄糖做基質(zhì)），耗氧，黏度，產(chǎn)熱等指標(biāo)， 都可用于生長(zhǎng)量的測(cè)定。也可以根據(jù)反應(yīng)前后的基質(zhì)濃度變化，最終產(chǎn)氣量，微生物活性三方面的測(cè)定反映微生物的生長(zhǎng)。如我所在BMP-2的發(fā)酵生產(chǎn)上，隨時(shí)監(jiān)測(cè)溶氧量的變化和酸堿度的變化，判斷細(xì)菌的長(zhǎng)勢(shì)。