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PCR操作步驟及注意

[2015/1/15]

　　PCR能快速特異擴(kuò)增任何已知目的基因或DNA片段，并能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴(kuò)增達(dá)到納克、微克、毫克級(jí)的特異性DNA片段。因此，PCR技術(shù)一經(jīng)問世就被迅速而廣泛地用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。它不僅可以用于基因的分離、克隆和核苷酸序列分析，還可以用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析，遺傳病和傳染病的診斷，腫瘤機(jī)制的探索，法醫(yī)鑒定等諸多方面。
　　PCR操作步驟:
　　1.在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。 10×PCR buffer 5 μl dNTP mix (2mM) 4 μl 引物1(10pM) 2 μl 引物2(10pM) 2 μl Taq酶 (2U/μl) 1 μl DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl 加ddH2O至 50 μl 視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
　　2. 調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，最后在72℃ 保溫7min。
　　3. 結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
　　4.PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μl氯仿進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油;否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
　　PCR注意事項(xiàng):
　　1.PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。最好設(shè)立一個(gè)專用的PCR實(shí)驗(yàn)室。
　　2.純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
　　3.所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
　　4.PCR試劑配制應(yīng)使用最高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
　　5.試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
　　6.試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
　　7.PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。