體外培養(yǎng)肝細胞的關鍵是如何分離得到形態(tài)完整、體外代謝活性高的肝細胞. 自1953年Anderson[2]首創(chuàng)剪切法從肝臟分離肝細胞以來, 各實驗室對肝細胞的分離方法進行了不斷改進. 在眾多方法中, 主要分為非灌流的方法和灌流的方法.

　　1.1 采用非灌流的方法

　　早期的研究一般通過非灌流這種簡單的步驟分離肝細胞.

　　1.1.1 機械分離法:

　　機械分離法是利用機械剪切及強力吹打等物理手段來分離肝細胞的方法[3]. 張頂 et al[4]在分離樹鼩肝細胞的過程中, 首先將樹鼩的肝臟剪成小塊, 然后通過擠壓、剪碎和震蕩等機械手段, 使肝細胞從肝組織上脫落, 從而獲得互相分離的肝細胞.

　　1.1.2 胰酶消化法:

　　胰酶消化法是利用胰酶來破壞肝細胞之間的橋連, 使肝細胞分離的一種方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶來分離猴腎細胞、大鼠肝細胞, 并運用到體外細胞的研究和培養(yǎng)中. 劉友平 et al[6]利用該方法分離肝細胞時, 首先取出小鼠的肝組織用眼科剪剪碎至糊狀, 然后用緩沖液充分清洗并加入胰酶進行消化. 待消化完全后用D-Hank’s液清洗, 最后加入含有血清的培養(yǎng)液終止胰酶的作用, 得到消化徹底的細胞懸液.

　　1.1.3 膠原酶消化法:

　　膠原酶消化法是利用膠原酶來破壞細胞間的纖維成分, 使肝細胞分離的一種方法. 王琳 et al[7]在利用該方法分離新生小鼠肝細胞時, 首先將新生小鼠的肝臟剪成1 mm3組織塊, 用無鈣無鎂的D-Hank’s液反復沖洗后加入膠原酶進行消化. 最后用DMEM液終止膠原酶的作用, 得到肝細胞懸液.

　　1.2 采用灌流的方法

　　雖然非灌流的方法以其簡單易行的特點得到了一定的應用, 但由于存在消化不完全、分離得到的肝細胞中多細胞團塊存在的問題, 不能滿足許多基礎研究或臨床應用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝臟灌流法, 灌流可以使消化液與肝組織更加充分地接觸, 不僅提高了分離效率, 還使分離所得肝細胞的活力和數量大大提高.

　　1.2.1 離體膠原酶灌流法:

　　離體膠原酶灌流法是將離體灌注與膠原酶消化相結合的方法. 在使用該方法分離肝細胞時, 首先將動物肝臟取出, 于門靜脈內置管或直接在獲得的肝組織塊的血管或切口內置管, 用預熱的無鈣無鎂的D-Hank’s液灌流. 然后換用膠原酶作持續(xù)灌流, 使肝細胞與間質分離. 最后用培養(yǎng)液終止膠原酶的消化作用, 過濾、離心、棄上清后得到肝細胞懸液.

　　1.2.2 Seglen兩步灌流法(原位膠原酶灌注法):

　　自從引入灌流法分離肝細胞以來, 許多學者根據不同的應用條件對灌流法進行了改良. 其中Seglen[10]經過一系列細致的研究, 創(chuàng)立了改良的Seglen兩步灌流法, 這一方法已成為應用至今的標準的原代肝細胞分離方法. 兩步灌流法主要是通過門靜脈先后用含EDTA或EGTA緩沖液和膠原酶緩沖液進行灌注來分離肝細胞的方法. 許多學者在具體操作中, 不斷改進兩步灌流法的灌注條件, 目的在于進一步減少分離過程中肝細胞的損傷, 提高肝細胞的活率.

　　1.2.3 半原位膠原酶灌流法:

　　半原位膠原酶灌流法是我國學者彭齊容 et al[13]以Seglen法為基礎建立的肝細胞分離技術. 俞紅 et al[14]在采用該方法分離乳豬肝細胞時, 首先用無鈣無鎂的D-Hank’s液于門靜脈進行原位灌注. 接著, 除保留門靜脈以外, 離斷肝臟血管并將肝臟移入無菌平皿中, 繼續(xù)用膠原酶進行灌注使肝細胞與間質細胞分離. 最后鈍性撕裂組織, 過濾洗滌后得到制備好的細胞懸液.

　　1.2.4 下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法:

　　下腔靜脈插管的逆向膠原酶灌注法是在肝下腔靜脈插管, 并結合逆向膠原酶灌注來分離肝細胞的方法[9]. 在采用該方法分離肝細胞時, 首先將灌注針逆向插入下腔靜脈后固定, 門靜脈開放做流出道. 接著用含EGTA或EDTA的灌注液進行灌注, 一段時間后再用含有Ca2+的膠原酶進行充分灌注. 灌流結束后, 將細胞過濾、清洗后得到制備好的肝細胞懸液.

　　1.2.5 Gerlach五步膠原酶灌流法:

　　在使用兩步灌流法分離大的肝組織塊時, 仍存在消化不完全的問題. 而Gerlach et al[15]在兩步灌流法的基礎上, 創(chuàng)立了聯合門靜脈和肝動脈的五步膠原酶灌流技術, 建立了一種高效的細胞分離方法.