1. primers design---這是最重要的一步。理想的，只同目的序列兩側(cè)的單一序列而非其它序列退火的primer要符合下面的一些條件：

　　1)足夠長，18~24bp，以保證特異性.當然不是說越長越好，太長的primer同樣會降低特異性，并且降低產(chǎn)量。

　　2) GC%：40%~60%

　　3) 5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性。

　　4) 避免3'端GC rich，最后3個BASE不要有GC，或者最后5個有3個不要是GC (3'端最好是GC/CG/CC/GG。)

　　5) 避免3'端的互補， 否則容易造成DIMER。

　　6) 避免3'端的錯配。

　　7) 避免內(nèi)部形成二級結(jié)構(gòu)。

　　8) 附加序列（RT site，Promoter sequence）加到5'端，在算Tm值時不算，但在檢測互補和二級結(jié)構(gòu)是要加上它們。

　　9) 使用兼并primer時，要參考密碼子使用表，注意生物的偏好性，不要在3'端使用兼并primer，并使用較高的primer濃度（1~3μM）。

　　10) 最好學會使用一種design software：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，Online design et al.

　　primer的另一個重要參數(shù)是熔解溫度（Tm）。這是當50％的primer和互補序列表現(xiàn)為雙鏈DNA分子時的溫度。Tm對于設(shè)定PCR退火溫度是必需的。在理想狀態(tài)下，退火溫度足夠低，以保證primer同目的序列有效退火，同時還要足夠高，以減少非特異性結(jié)合。合理的退火溫度從55~70℃。退火溫度一般設(shè)定比primer的Tm低5℃。

　　設(shè)定Tm有幾種公式。有的是來源于高鹽溶液中的雜交，適用于小于18堿基的primer。有的是根據(jù)GC含量估算Tm。確定primerTm最可信的方法是近鄰分析法。這種方法從序列一級結(jié)構(gòu)和相鄰堿基的特性預測primer的雜交穩(wěn)定性。大部分計算器程序使用近鄰分析法。

　　根據(jù)所使用的公式及primer序列的不同，Tm會差異很大。因為大部分公式提供一個估算的Tm值，所有退火溫度只是一個起始點�？梢酝ㄟ^分析幾個逐步提高退火溫度的反應以提高特異性。開始低于估算的Tm5℃，以2℃為增量，逐步提高退火溫度。較高的退火溫度會減少primer二聚體和非特異性產(chǎn)物的形成。

　　為獲得好的結(jié)果，兩個primer應具有近似的Tm值。primer對的Tm差異如果超過5℃，就會primer在循環(huán)中使用較低的退火溫度而表現(xiàn)出明顯的錯誤起始。如果兩個primerTm不同，將退火溫度設(shè)定為比最低的Tm低5℃。

　　或者為了提高特異性，可以在根據(jù)較高Tm設(shè)計的退火溫度先進行5個循環(huán)，然后在根據(jù)較低Tm設(shè)計的退火溫度進行剩余的循環(huán)。這使得在較為嚴緊的條件下可以獲得目的模板的部分拷貝。

　　2. stability of primers---定制primer的標準純度對于大多數(shù)PCR應用是足夠的。

　　primer產(chǎn)量受合成化學的效率及純化方法的影響。定制primer以干粉形式運輸。最好在TE重溶primer，使其最終濃度為100μM。TE比去離子水好，因為水的pH經(jīng)常偏酸，會引起寡核甘的水解。primer的穩(wěn)定性依賴于儲存條件。應將干粉和溶解的primer儲存在-20℃。以大于10μM濃度溶于TE的primer在-20℃可以穩(wěn)定保存6個月，但在室溫（15℃~30℃）僅能保存不到1周。干粉primer可以在-20℃保存至少1年，在室溫（15℃~30℃）最多可以保存2個月。