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融合蛋白的免疫篩選實驗

[2015/11/20]

實驗材料    大腸桿菌 
試劑、試劑盒    LB頂層瓊脂糖疊氮鈉第一抗體 
儀器、耗材    硝酸纖維素濾膜 
抗體    CD2抗體 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗體 
山羊Complement C4多克隆抗體 

實驗步驟:     
1. 150 ml LB平板上滴定λgt11 cDNA文庫的滴度,宿主菌為大腸桿菌LE392菌株,每個平板使用7 ml 1%LB頂層瓊脂。 
2. 選擇適當?shù)牡味蠕伷桨,?/FONT>37℃溫育8h。 
3. 將直徑132 mm硝酸纖維素濾膜分別編號,放入上述已培養(yǎng)8 h的平板中,于37℃溫育。 
4. 用針頭刺孔并用印度墨汁在每張濾膜上作一標記,然后取出濾膜。 
5. 在室溫用免疫篩選緩沖液洗膜30 min,以封閉濾膜并洗去膜上的殘留細菌,重復洗滌2~4次。 
6. 將第一抗體(稀釋于免疫篩選緩沖液中,終濃度為0.5~10 μg/ml)加到裝有濾膜的塑料袋中,熱封口后置40℃水平搖床上反應2~24h。 
7.  4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次,毎次5~10min。 
8.  接著將125I 標記的第二抗體(0.5×106cpm/ml)加入裝有濾膜的熱封塑料袋中,4℃反應2~6 h。 
9.  4℃用免疫篩選緩沖液洗膜4~5次,然后用濾紙將濾膜上的液體吸干。 
10.  用塑料保鮮膜包裹好濾膜,使用增感屏在-70℃對X光片曝光。 
11.  通過反復稀釋,純化λ噬菌體cDNA融合蛋白克隆,最終獲得單一的陽性克隆。 
12.  培養(yǎng)陽性克隆,制備重組λ噬菌體DNA。 

IPTG法 
實驗方法原理用抗體篩選λgt11 cDNA文庫時,可待噬斑長到一定裎度方可誘導表達融合蛋白,篩選到陽性克隆的成功概率就可能大大增加。噬菌體生長3~4 h后,將含誘導劑IPTG的濾膜放入噬斑平板,即可誘導β-半乳糖苷酶-cDNA融合蛋白的表達,繼續(xù)在37℃培養(yǎng),然后按基本方案用抗體對影印濾膜進行篩選。 

實驗材料    大腸桿菌 
試劑、試劑盒    IPTG 
儀器、耗材    培養(yǎng)箱牙簽硝酸纖維素膜 
抗體    CD2抗體 
山羊Lambda Light Chain多克隆抗體 
山羊Complement C4多克隆抗體 

實驗步驟     
1.  1×104~5×104融合有cDNA的λ噬菌體感染0.5~1.0 ml 培養(yǎng)的Y1090新鮮菌懸液。 
2.  加入預熱到47℃的7 ml 頂層瓊脂中,鋪150 mm LB平板,42℃培養(yǎng)3.5 h。 
3.  132 mm 直徑的硝酸纖維素濾膜故入10 mmol/l IPTG溶液中浸泡后,取出干燥。 
4.  再將含IPTG的濾膜放入噬菌體文庫平板中,37℃培養(yǎng)3.5 h。 
5.  每張濾膜作好標記后取出,封閉濾膜上的剩余的蛋白結合位點并進行雜交檢測。