外泌體最早發(fā)現(xiàn)于體外培養(yǎng)的綿羊紅細(xì)胞上清液中，是細(xì)胞主動(dòng)分泌的大小較為均一，直徑為40~100納米，密度1.10~1.18 g/ml的囊泡樣小體。

　　細(xì)胞外泌體攜帶多種蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA，參與細(xì)胞通訊、細(xì)胞遷移、血管新生和腫瘤細(xì)胞生長等過程并且有可能成為藥物的天然載體，應(yīng)用于臨床治療。然而，測量技術(shù)手段的局限限制了外泌體在這些領(lǐng)域的研究進(jìn)展。所以，在這篇文章中，總結(jié)了外泌體的純化方法，比較了現(xiàn)存各種外泌體測量技術(shù)，重點(diǎn)介紹了一種新的測量技術(shù)，納米微粒追蹤分析術(shù)，在外泌體尺寸和表征研究中的應(yīng)用。

　　1. 外泌體提取及方法學(xué)評價(jià)

　　到目前為止，仍沒有一種方法能同時(shí)保證外泌體的含量、純度、生物活性。

　　1.1 離心法

　　這是目前外泌體提取最常用的方法。簡單來說，收集細(xì)胞培養(yǎng)液以后依次在300 g、2 000 g、10 000 g離心去除細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100 000 g離心得到外泌體。此種方法得到的外泌體量多，但是純度不足，電鏡鑒定時(shí)發(fā)現(xiàn)外泌體聚集成塊，由于微泡和外泌體沒有非常統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，也有一些研究認(rèn)為此種方法得到的是微泡不是外泌體。

　　1.2 過濾離心

　　過濾離心是利用不同截留相對分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體。截留相對分子質(zhì)量是指能自由通過某種有孔材料的分子中最大分子的相對分子質(zhì)量。外泌體是一個(gè)囊狀小體，相對分子質(zhì)量大于一般蛋白質(zhì)，因此選擇不同大小的MWCO膜可使外泌體與其他大分子物質(zhì)分離。這種操作簡單、省時(shí)，不影響外泌體的生物活性，但同樣存在純度不足的問題。

　　1.3 密度梯度離心法

　　密度梯度離心是將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區(qū)，分為連續(xù)和不連續(xù)梯度離心法。用于密度梯度離心法的介質(zhì)要求對細(xì)胞無毒，在高濃度時(shí)粘度不高且易將pH調(diào)至中性。實(shí)驗(yàn)中常用蔗糖密度梯度離心法，在離心法的基礎(chǔ)上，預(yù)先將兩種濃度蔗糖溶液(如2.5 M 和0.25 M)配成連續(xù)梯度體系置于超速離心管中，樣本鋪在蔗糖溶液上，100 000 g離心16 h，外泌體會(huì)沉降到等密度區(qū)(1.10~1.18 g/ml)。用此種方法分離到的外泌體純度高，但是前期準(zhǔn)備工作繁雜，耗時(shí)，量少。

　　1.4 免疫磁珠法

　　免疫磁珠是包被有單克隆抗體的球型磁性微粒，可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合。同樣，在離心法的基礎(chǔ)上，預(yù)先使磁珠包被針對外泌體相關(guān)抗原的抗體(如CD9、 CD63、Alix)與外泌體共同孵育，蒸餾水沖洗后，重懸于PBS緩沖液中。這種方法可以保證外泌體形態(tài)的完整，特異性高、操作簡單、不需要昂貴的儀器設(shè)備, 但是非中性pH和非生理性鹽濃度會(huì)影響外泌體生物活性，不便進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)。

　　1.5 色譜法

　　色譜法是利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對關(guān)系而對溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析方法。樣品中大分子不能進(jìn)入凝膠孔，只能沿多孔凝膠粒子之間的空隙通過色譜柱，首先被流動(dòng)相洗脫出來;小分子可進(jìn)入凝膠中絕大部分孔洞，在柱中受到更強(qiáng)地滯留，更慢地被洗脫出。分離到的外泌體在電鏡下大小均一，但是需要特殊的設(shè)備，應(yīng)用不廣泛。

　　2. 外泌體測量各種方法的比較

　　2.1 電子顯微鏡

　　掃描電子顯微鏡(SEM)的工作原理是以能量為1-30KV間的電子束，以光柵狀掃描方式照射到被分析試樣的表面上，利用入射電子和試樣表面物質(zhì)相互作用所產(chǎn)生的二次電子和背散射電子成象，獲得試樣表面微觀組織結(jié)構(gòu)和形貌信息。高的分辨率。由于超高真空技術(shù)的發(fā)展，場發(fā)射電子槍的應(yīng)用得到普及，現(xiàn)代先進(jìn)的掃描電鏡的分辨率已經(jīng)達(dá)到1納米左右，足夠用來進(jìn)行外泌體尺寸的測量。鑒于SEM的工作特點(diǎn)，在外泌體研究中，能夠直接觀察到樣品中外泌體的形態(tài)。并且SEM具有很高的分辨率，能夠鑒別不同大小不一的外泌體。但SEM對樣品的預(yù)處理和制備上面要求較高，樣品的準(zhǔn)備階段比較復(fù)雜，不適合對外泌體進(jìn)行大量快速的測量。而且由于外泌體經(jīng)過了預(yù)處理和制備過程，無法準(zhǔn)確的進(jìn)行外泌體濃度的測量。

　　2.2 動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)

　　動(dòng)態(tài)光散射是收集溶液中做布朗運(yùn)動(dòng)的顆粒散射光強(qiáng)度起伏的變化，通過相關(guān)器將光強(qiáng)的波動(dòng)轉(zhuǎn)化為相關(guān)曲線，從而得到光強(qiáng)波動(dòng)的速度，計(jì)算出粒子的擴(kuò)散速度信息和粒子的粒徑。小顆粒樣品的布朗運(yùn)動(dòng)速度快，光強(qiáng)波動(dòng)較快，相關(guān)曲線衰減較快，大顆粒反之(圖1)。

　　在外泌體研究中，動(dòng)態(tài)光散射測量敏感度較高，測量下限為10納米。相對于SEM技術(shù)來說，樣品制備簡單，只需要簡單的過濾，測量速度較快。但是動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)由于是測量光強(qiáng)的波動(dòng)數(shù)據(jù)，所以大顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號會(huì)掩蓋較小顆粒的光強(qiáng)波動(dòng)信號，所以動(dòng)態(tài)光散射不適合大小不一的復(fù)雜外泌體樣本的測量，只適合通過色譜法制備的大小均一的外泌體的尺寸測量，并且無法測量樣品中外泌體的濃度。

　　2.3 納米微粒追蹤分析術(shù)

　　納米微粒追蹤分析術(shù)(以下簡稱NTA)是一種比較新穎的研究納米顆粒的方法，它可以直接和實(shí)時(shí)的觀測納米顆粒。NTA通過光學(xué)顯微鏡收集納米顆粒的散射光信號，拍攝一段納米顆粒在溶液中做布朗運(yùn)動(dòng)的影像，對每個(gè)顆粒的布朗運(yùn)動(dòng)進(jìn)行追蹤和分析，從而計(jì)算出納米顆粒的流體力學(xué)半徑和濃度。

　　NTA系統(tǒng)的工作原理是將一束能量集中的激光穿過玻璃棱鏡對樣品(懸浮顆粒的溶液)進(jìn)行照射(光路圖見圖2)。

　　激光光束從較小角度入射進(jìn)入樣品溶液，照亮溶液中的顆粒。配備相機(jī)的光學(xué)顯微鏡，被放置在特定的位置上，收集視野中被照亮的納米顆粒發(fā)射出的光散射信號。 樣品池有大約500微米的深度，采樣點(diǎn)激光照亮寬度為20微米，這個(gè)數(shù)值和光學(xué)顯微鏡的聚焦的視野深度相匹配。相機(jī)會(huì)進(jìn)行60秒的影像拍攝，每秒30個(gè)采樣畫面。顆粒的運(yùn)動(dòng)過程被NTA軟件進(jìn)行分析。NTA軟件在每幅被記錄的畫面中鑒別和追蹤做布朗運(yùn)動(dòng)的納米顆粒。

　　根據(jù)顆粒的運(yùn)動(dòng)速度，通過二維 Stokes-Einstein方程計(jì)算顆粒流體力學(xué)半徑

　　在方程中2是均方位移，KB是Boltzmann常數(shù); T是溶液的溫度，單位是Kelvin;ts是采樣時(shí)間，例如，1/30 fpsec = 33 msec;η是溶液粘度;dh是流體力學(xué)直徑。 NTA檢測顆粒大小的范圍和顆粒本身的折光指數(shù)相關(guān)。測量的下限取決于被研究顆粒和背景之間信噪比，也就是顆粒的散射光強(qiáng)度和背景的光強(qiáng)差距。顆粒的散射光強(qiáng)度根據(jù)Rayleigh散射方程，受到以下因素的影響

　　由于NTA技術(shù)是直接追蹤樣品中每一個(gè)納米顆粒，決定了NTA對復(fù)雜的樣品具有極高的分辨率，為了證明NTA對于復(fù)雜樣品的分辨能力，我們將100納米和300納米兩種不同大小的聚苯乙烯顆粒按照5:1的數(shù)量混合，使用NTA進(jìn)行測量(圖3A)。盡管其分布圖形有一定的重疊，但兩種不同大小的納米顆粒的峰清楚的區(qū)分開來。這種對復(fù)雜樣品的分辨能力對于外泌體這樣的研究對象來說是非常重要的。

　　NTA也能對樣品濃度進(jìn)行直接測量。對一系列濃度為1×108-8×108的100納米單分散樣品進(jìn)行測量，可以看到NTA測量濃度結(jié)果和實(shí)際濃度存在著很好的線性相關(guān)(圖3B)。對于多分散體系，測量結(jié)果的準(zhǔn)確取決于儀器參數(shù)的設(shè)定(照相機(jī)快門速度和光圈)，恰當(dāng)?shù)膮?shù)設(shè)定可以保證不同大小顆粒都被NTA軟件追蹤和計(jì)算。

　　NTA還具有分析熒光樣品的能力，NTA有四種不同波長405納米, 488納米, 532納米和635納米的激光器可以選擇，在搭配相應(yīng)的濾光片，從而實(shí)現(xiàn)對熒光樣品的測量。將100納米的熒光標(biāo)記的顆粒和200納米的非熒光顆粒用同一溶劑做成混合樣品，使用NTA進(jìn)行測量(圖4)，圖4中，藍(lán)色的線顯示為NTA的光散射模式，可以看到盡管100納米和200nm納米顆粒的分布圖有重疊，但還是清楚的區(qū)分了100納米和200納米的峰值。然后使用熒光濾光片進(jìn)行分析，只觀測到100納米的熒光標(biāo)記的納米顆粒(紅線)

　　由于外泌體表面有標(biāo)志物CD9，CD63等跨膜分子的存在，在復(fù)雜的背景環(huán)境下(如血清中)，可以用熒光抗體標(biāo)記外泌體，在用NTA的熒光測量功能實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜背景下對外泌體的測量。NTA相比較于流式細(xì)胞儀的熒光功能，分辨率較高，測量熒光顆粒的下限可以達(dá)到30-40納米，而流式細(xì)胞儀的測量下限為 400納米，即使對于最新一代的數(shù)碼流式細(xì)胞儀，其測量下限已經(jīng)達(dá)到100納米，但由于它仍然建立在監(jiān)測光信號的基礎(chǔ)上，所以測量和準(zhǔn)確性和分辨率仍然不可靠。所以在外泌體熒光功能測量上，NTA具有獨(dú)特的優(yōu)勢。

　　3. 總結(jié)

　　外泌體作為生物標(biāo)志物的研究目前處于起步階段，但臨床應(yīng)用已顯示出良好的前景。 在臨床診斷中，簡單快速的在復(fù)雜的生物背景下(如血漿，尿液)測量外泌體濃度，大小和表征數(shù)據(jù)是必備的要求。目前存在的方法都無法完美的解決這一問題。 NTA作為一個(gè)相對新的測量技術(shù)，具有實(shí)時(shí)觀測，較高的分辨率，準(zhǔn)確的濃度測量和熒光測量功能，提供了對外泌體大小和濃度研究的新的思路。