上個(gè)世紀(jì)初，科學(xué)家們認(rèn)為蛋白質(zhì)是生命體的遺傳物質(zhì)，而具有獨(dú)特的作用。隨著這個(gè)理論被證偽，真正的遺傳物質(zhì)DNA的結(jié)構(gòu)被給予了很大關(guān)注。然而，蛋白質(zhì)作為生命體的重要大分子，其重要性也從未被忽視，而且在1950年代開(kāi)始，科學(xué)家一直在探尋DNA序列和蛋白質(zhì)序列的相關(guān)性。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)測(cè)序和結(jié)構(gòu)解析蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的努力開(kāi)始慢慢獲得回報(bào)。更多的生化研究揭示了蛋白質(zhì)的功能重要性，因此蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)的解析對(duì)于深入理解蛋白質(zhì)功能和生理現(xiàn)象起著決定性作用。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析六十年來(lái)大事件

　　在1958年，英國(guó)科學(xué)家John Kendrew和Max Perutz首先發(fā)表了用X射線衍射得到的高分辨率的肌紅蛋白Myoglobin的三維結(jié)構(gòu)，然后是更加復(fù)雜的血紅蛋白Hemoglobin。因此，這兩個(gè)科學(xué)家分享了1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。事實(shí)上，這項(xiàng)工作在早在1937年就開(kāi)始了。

　　然后在1960年代，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法不斷進(jìn)步，獲得了更高的解析精度。這個(gè)時(shí)期，蛋白質(zhì)序列和DNA序列間關(guān)系也被發(fā)現(xiàn)，中心法則被Francis Crick提出，然后科學(xué)界見(jiàn)證了分子生物學(xué)的崛起。分子生物學(xué)(Molecular Biology)的名稱在1962年開(kāi)始被廣泛接受和使用，并逐漸演變出一些支派，如結(jié)構(gòu)生物學(xué)。然后在1964年，Aaron Klug提出了一種基于X射線衍射原理發(fā)展而來(lái)的全新的方法電子晶體學(xué)顯微鏡(crystallographic electron microscopy )，可以解析更大蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)核酸復(fù)合體結(jié)構(gòu)。因?yàn)檫@項(xiàng)研究，他獲得了1982諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。1969年，Benno P. Schoenborn 提出可以用中子散射和原子核散射來(lái)確定大分子中固定位置的氫原子坐標(biāo)。

　　進(jìn)入1970年代，很多新的方法開(kāi)始發(fā)展。存儲(chǔ)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的Protein Data Bank(1971年) 開(kāi)始出現(xiàn)，這對(duì)于規(guī)范化和積累蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)有著重要意義。1975年新的一種儀器叫做多絲區(qū)域檢測(cè)器，讓X-ray的檢測(cè)和數(shù)據(jù)收集更加快速高效。次年，Robert Langride將X-ray衍射數(shù)據(jù)可視化，并在加州大學(xué)圣地亞哥分校成立了一個(gè)計(jì)算機(jī)圖形實(shí)驗(yàn)室。同年，KeithHodgson和同事首次證明了可以使用同步加速器獲得的X射線并對(duì)單個(gè)晶體進(jìn)行照射，并取得了很好的實(shí)驗(yàn)效果。然后在1978年，核磁共振NMR首次被用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析;同年首個(gè)高精度病毒(西紅柿叢矮病毒)衣殼蛋白結(jié)構(gòu)被解析。

　　在1980年代，更多蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)被解析，蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的描述越來(lái)越成熟，而且蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析也被公認(rèn)成為藥物研發(fā)的關(guān)鍵步驟。在1983年，冷凍蝕刻的煙草花葉病毒結(jié)構(gòu)在電子顯微鏡結(jié)構(gòu)下得到描述。兩年后德國(guó)科學(xué)家John Deisenhofer等解析出了細(xì)菌光合反應(yīng)中心，因此他們共享了1988年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。次年，兩個(gè)課題組解析了HIV與復(fù)制相關(guān)的蛋白酶結(jié)構(gòu)，對(duì)針對(duì)HIV的藥物研發(fā)提供了理論基礎(chǔ)。

　　下一個(gè)十年，因?yàn)榇罅客郊铀倨鬏o助的X射線衍射的使用，數(shù)千個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析，迎來(lái)了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組的曙光。1990年多波長(zhǎng)反常散射方法(MAD)方法用于X射線衍射晶體成像，與同步輻射加速器一起，成為了近二十多年來(lái)的最常用的的方法。Rod MacKinnon在199年發(fā)表了第一個(gè)高精度的鉀離子通道蛋白結(jié)構(gòu)，對(duì)加深神經(jīng)科學(xué)的理解起了重要作用，因此他分享了2003年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。Ada Yonath等領(lǐng)導(dǎo)的課題組在1999年首次解析了核糖體結(jié)構(gòu)(一種巨大的RNA蛋白質(zhì)復(fù)合體)。

　　進(jìn)入新千年，更多的技術(shù)細(xì)節(jié)被加入到蛋白質(zhì)解析研究領(lǐng)域。2001年，Roger Kornberg和同事們描述了第一個(gè)高精度的RNA聚合酶三維結(jié)構(gòu)，正因此五年后他們共享了諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。2007年，首個(gè)G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)構(gòu)的解析更是對(duì)藥物研究帶了新的希望。近些年來(lái)，越來(lái)越多的大的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)得到解析。Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像用于超大蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)成像的研究日益成熟，并開(kāi)始廣泛用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的解析。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的常用實(shí)驗(yàn)方法

　　1.X-ray衍射晶體學(xué)成像

　　X射線衍射晶體學(xué)是最早用于結(jié)構(gòu)解析的實(shí)驗(yàn)方法之一。X射線是一種高能短波長(zhǎng)的電磁波(本質(zhì)上屬于光子束)，被德國(guó)科學(xué)家倫琴發(fā)現(xiàn)，故又被稱為倫琴射線。理論和實(shí)驗(yàn)都證明了，當(dāng)X射線打擊在分子晶體顆粒上的時(shí)候，X射線會(huì)發(fā)生衍射效應(yīng)，通過(guò)探測(cè)器收集這些衍射信號(hào)，可以了解晶體中電子密度的分布，再據(jù)此析獲得粒子的位置信息。利用這種特點(diǎn)，布拉格父子研制出了X射線分光計(jì)并測(cè)定了一些鹽晶體的結(jié)構(gòu)和金剛石結(jié)構(gòu)。首個(gè)DNA結(jié)構(gòu)的解析便是利用X射線衍射晶體學(xué)獲得的。

　　后來(lái)，獲得X射線來(lái)源的技術(shù)得到了改進(jìn)，如今更多地使用同步輻射的X射線源。來(lái)自同步輻射的X射線源可以調(diào)節(jié)射線的波長(zhǎng)和很高的亮度，結(jié)合多波長(zhǎng)反常散射技術(shù)，可以獲得更高精度的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，也成為了當(dāng)今主流的X射線晶體成像學(xué)方法。由X射線衍射晶體學(xué)解析的結(jié)構(gòu)在RCSB Protein Data Bank中占到了88%。

　　X射線衍射成像雖然得到了長(zhǎng)足的發(fā)展，仍然有著一定的缺點(diǎn)。X射線對(duì)晶體樣本有著很大的損傷，因此常用低溫液氮環(huán)境來(lái)保護(hù)生物大分子晶體，但是這種情況下的晶體周圍環(huán)境非常惡劣，可能會(huì)對(duì)晶體產(chǎn)生不良影響。而且，X射線衍射方法不能用來(lái)解析較大的蛋白質(zhì)。

　　2.NMR核磁共振成像

　　核磁共振成像NMR全稱Nuclear magnetic resonance，最早在1938被Isidor Rabi (1946年諾貝爾獎(jiǎng))描述，在上世紀(jì)的后半葉得到了長(zhǎng)足發(fā)展。其基本理論是，帶有孤對(duì)電子的原子核(自選量子數(shù)為1)在外界磁場(chǎng)影響下，會(huì)導(dǎo)致原子核的能級(jí)發(fā)生塞曼分裂，吸收并釋放電磁輻射，即產(chǎn)生共振頻譜。這種共振電磁輻射的頻率與所處磁場(chǎng)強(qiáng)度成一定比例。利用這種特性，通過(guò)分析特定原子釋放的電磁輻射結(jié)合外加磁場(chǎng)分別，可以用于生物大分子的成像或者其他領(lǐng)域的成像。有些時(shí)候，NMR也可以結(jié)合其他的實(shí)驗(yàn)方法，比如液相色譜或者質(zhì)譜等。

　　RCSB Protein Data Bank數(shù)據(jù)庫(kù)中存在大約11000個(gè)用NMR解析的生物大分子結(jié)構(gòu)，占到總數(shù)大約10%的結(jié)構(gòu)。NMR結(jié)構(gòu)解析多是在溶液狀態(tài)下的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，一般認(rèn)為比起晶體結(jié)構(gòu)能夠描述生物大分子在細(xì)胞內(nèi)真實(shí)結(jié)構(gòu)。而且，NMR結(jié)構(gòu)解析能夠獲得氫原子的結(jié)構(gòu)位置。然而，NMR也并非萬(wàn)能，有時(shí)候也會(huì)因?yàn)榈鞍踪|(zhì)在溶液中結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定能難得獲取穩(wěn)定的信號(hào)，因此，往往借助計(jì)算機(jī)建模或者其他方法完善結(jié)構(gòu)解析流程。

　　使用NMR解析的血紅蛋白結(jié)構(gòu)建模(圖片來(lái)源RCSB PDB)

　　3.Cryo-EM超低溫電子顯微鏡成像

　　電子顯微鏡最早出現(xiàn)在1931年，從設(shè)計(jì)之初就是為了試圖獲得高分辨率的病毒圖像。通過(guò)電子束打擊樣本獲得電子的反射而獲取樣本的圖像。而圖像的分辨率與電子束的速度和入射角度相關(guān)。通過(guò)加速的電子束照射特殊處理過(guò)的樣品表明，電子束反射，并被探測(cè)器接收，并成像從而獲得圖像信息。具體做法是，將樣品迅速至于超低溫(液氮環(huán)境)下并固定在很薄的乙烷(或者水中)，并置于樣品池，在電子顯微鏡下成像。圖像獲得后，通過(guò)分析圖像中數(shù)量眾多的同一種蛋白質(zhì)在不同角度的形狀，進(jìn)行多次的計(jì)算機(jī)建模從而可以獲得近原子級(jí)別的精度(最低可以到2.0埃)。

　　Cyro-EM解析TRPV1離子通道蛋白(圖片來(lái)源Structure of the TRPV1 ion channel )

　　將電子顯微鏡和計(jì)算機(jī)建模成像結(jié)合在一起的大量實(shí)踐還是在新世紀(jì)之后開(kāi)始流行的。隨著捕捉電子的探測(cè)器技術(shù)(CCD技術(shù)，以及后來(lái)的高精度電子捕捉、電子計(jì)數(shù)electron counting設(shè)備)的提升，更多的信息和更低的噪音保證了高分辨率的圖像。

　　近些年來(lái)，Cryo-EM被用來(lái)解析很多結(jié)構(gòu)非常大(無(wú)法用X-ray解析)的蛋白質(zhì)(或者蛋白質(zhì)復(fù)合體)，取得了非常好的結(jié)果。同時(shí)，單電子捕捉技術(shù)取代之前的光電轉(zhuǎn)換成像的CCD攝像設(shè)備，減少了圖像中的噪音和信號(hào)衰減，同時(shí)并增強(qiáng)了信號(hào)。計(jì)算機(jī)成像技術(shù)的成熟和進(jìn)步，也賦予了Cryo-EM更多的進(jìn)步空間。然而，Cyro-EM與X-ray不同，該方法不需要蛋白質(zhì)成為晶體，相同的是都需要低溫環(huán)境來(lái)減少粒子束對(duì)樣品的損害。

　　除去介紹的這三種方法以外，計(jì)算機(jī)建模技術(shù)也越來(lái)越多地被用在了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析中。而且新解析的結(jié)構(gòu)也會(huì)提高計(jì)算機(jī)建模的精確度。未來(lái)，我們或許能夠用計(jì)算機(jī)構(gòu)建原子級(jí)別的細(xì)胞模型，構(gòu)建在芯片上的細(xì)胞。

　　蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)對(duì)了解生命體的生化反應(yīng)、有針對(duì)性的藥物研發(fā)有著重要意義。從1958到如今已經(jīng)接近60年，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析得到了較快的發(fā)展。然而，在如今DNA測(cè)序如此高效廉價(jià)的時(shí)代，蛋白質(zhì)和DNA結(jié)構(gòu)解析并沒(méi)有進(jìn)入真正高速發(fā)展階段，這也導(dǎo)致了在如此多的DNA序列數(shù)據(jù)非常的今天，結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)卻相對(duì)少的可憐。大數(shù)據(jù)時(shí)代的基因組、蛋白質(zhì)組、代謝組、脂類組等飛速發(fā)展的時(shí)候，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)組也得到了更加廣泛的重視。發(fā)展高精度、高效的結(jié)構(gòu)解析技術(shù)也一直都有著重要意義。未來(lái)，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析，對(duì)針對(duì)蛋白質(zhì)的藥物篩選，和計(jì)算機(jī)輔助的藥物研究研究不應(yīng)被低估。未來(lái)說(shuō)不定在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)領(lǐng)域有著更多驚喜，我們拭目以待。