三月二十日，來自中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、武漢菲沙基因信息有限公司(Frasergen)和加拿大西蒙佛雷澤大學(xué)的研究人員，在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊《Journal of BioLogical Chemistry》發(fā)表學(xué)術(shù)論文，該研究檢測(cè)了iPSC生成及隨后基因校正過程中的基因組不穩(wěn)定性，指出重編程和基因打靶可能會(huì)產(chǎn)生大量但卻不同的基因組變化，因此，在iPSC誘導(dǎo)時(shí)及基因打靶之后，必須進(jìn)行嚴(yán)格的基因組監(jiān)控和選擇。

本文通訊作者是中科院生物醫(yī)藥與健康研究院研究員潘光錦博士，其2002年碩士畢業(yè)于山東醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2005年博士畢業(yè)于清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院，隨后在美國(guó)威斯康星大學(xué)-麥迪遜從事博士后研究，2010年至今為中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院研究員。主要從事人胚胎干(ES)細(xì)胞多能性及自我更新的分子生物學(xué)調(diào)控和人誘導(dǎo)性多能干(iPS)細(xì)胞的形成及臨床應(yīng)用的可行性實(shí)驗(yàn)室研究，研究成果曾經(jīng)發(fā)表在Cell、Cell Stem Cell、FASEB J、JBC等國(guó)際學(xué)術(shù)期刊。

人體誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)，可以進(jìn)行無限的自我更新，同時(shí)又保持產(chǎn)生體內(nèi)所有類型體細(xì)胞的潛力，從而為發(fā)育生物學(xué)研究、疾病模型，以及在再生醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用開辟了新的途徑。將iPSCs生成與靶向基因組編輯相結(jié)合，的確已被用于構(gòu)建各種遺傳疾病的模型，包括β-Thal。

β-Thal是世界上最常見的一種遺傳性疾病，患者患有嚴(yán)重貧血，需要定期輸血。這種疾病是由β血紅蛋白基因(HBB)突變或缺失引起的，可破壞正常紅血細(xì)胞的功能。目前，從健康供體移植骨髓，是治愈β-Thal的唯一方法，但這種治療受到人類白細(xì)胞抗原(HLA)匹配供體缺乏的限制。

從理論上講，在突變HBB靶向基因組校正后從β-Thal患者生成iPSCs，可能是這些疾病一種理想的新療法。最近開發(fā)的基因組編輯工具，如鋅指核酸酶(ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活因子樣核酸酶(TALENs)和聚集調(diào)節(jié)間隔短回文重復(fù)(CRISPR)/Cas9為基礎(chǔ)的RNA引導(dǎo)DNA內(nèi)切酶，大大提高了人類iPSCs或ESCs的基因打靶效率，從而能夠生成個(gè)性化的、基因校正的iPSCs用于細(xì)胞治療。然而，重編程和隨后的基因打靶步驟，是否會(huì)生成有害的的基因組變化，在這種類型用細(xì)胞治療用于臨床實(shí)踐之前還需要進(jìn)行評(píng)估。

產(chǎn)生基因校正的iPSCs ，需要因子誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程和核酸酶輔助的基因打靶步驟。重編程或基因打靶技術(shù)對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響，已經(jīng)吸引了諸多關(guān)注。例如，據(jù)報(bào)道，iPSCs比其他細(xì)胞系(比如ES細(xì)胞或體細(xì)胞)攜帶更頻繁的CNVs。這些CNVs中的一些確實(shí)歸因于細(xì)胞重組過程。然而，另一項(xiàng)研究報(bào)道了極少數(shù)的核苷酸水平變化，如非同義SNVs和INDELS，在通過非病毒方法產(chǎn)生的iPS細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)。同樣，基因組編輯工具(如TALENs或CRISPR/cas9)對(duì)基因組穩(wěn)定性的影響也被分析過。一般來說，基于全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，這些基因組編輯工具似乎沒有引起太多的基因組變化，表明這些工具應(yīng)用于臨床可能是安全的。

這項(xiàng)研究的目的是，通過基因校正的β-Thal iPSCs產(chǎn)生過程，檢測(cè)所產(chǎn)生的基因組變化，包括通過非病毒方法、克隆選擇、擴(kuò)增、基因組編輯和外源基因切除的iPSC生成。首先，研究人員用攜帶HBB第二內(nèi)含子(位點(diǎn)654)純合點(diǎn)突變的羊水細(xì)胞，生成了一個(gè)非整合型的β-Thal iPSC細(xì)胞系。

然后，研究人員通過ZFN輔助的基因打靶和外源耐藥基因切除，校正了兩個(gè)突變的HBB等位基因，以獲得最終的HBB校正iPSCs。接下來，研究人員對(duì)親代細(xì)胞進(jìn)行了連續(xù)的CGHs和外顯子組測(cè)序。

這些研究結(jié)果表明，即使用非病毒方法，iPSC誘導(dǎo)也可能會(huì)產(chǎn)生一定數(shù)量的變化，包括CNVs和SNVs。同時(shí)，隨后的ZFN輔助基因打靶會(huì)造成可以忽略的CNVs，但是更多的SNVs。分析結(jié)果表明，因素誘導(dǎo)的體細(xì)胞重編程和ZFN輔助的基因打靶，往往會(huì)產(chǎn)生不同的基因組變化。在個(gè)性化基因校正iPSC細(xì)胞治療應(yīng)用于臨床之前，需要對(duì)這些變化進(jìn)行仔細(xì)的分析和評(píng)估。