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三分鐘帶你了解當(dāng)前最熱的基因編輯技術(shù)

[2017/4/13]

基因編輯技術(shù)指能夠讓人類對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行“編輯”，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，就有著其它基因編輯技術(shù)無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，技術(shù)不斷改進(jìn)后，更被認(rèn)為能夠在活細(xì)胞中最有效、最便捷地“編輯”任何基因。基因編輯是一種遺傳工程技術(shù)，針對(duì)某個(gè)序列已知但功能未知的序列，通過(guò)改變生物的遺傳基因，使其特定的基因功能喪失作用，通過(guò)研究對(duì)生物體造成的影響，進(jìn)而推測(cè)出該基因的生物學(xué)功能。本文為你科普基因編輯三大技術(shù)：
　　
　　基因敲除
　　
　　進(jìn)行DNA水平編輯。一般用于構(gòu)建基因敲除鼠模型。
　　
　　CRISPR/Cas9：CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為細(xì)菌和古細(xì)菌的獲得性免疫系統(tǒng)，通過(guò)RNA介導(dǎo)特異性的切割外源遺傳物質(zhì)，用以對(duì)抗入侵的病毒和質(zhì)粒。使用Cas9切口酶和一對(duì)sgRNA，兩個(gè)相近的切口造成DNA雙鏈斷裂，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生非同源末端連接修復(fù)，造成目的基因的突變。
　　
　　CRISPR/Cas9技術(shù)自問(wèn)世以來(lái)，取代“鋅指核酸內(nèi)切酶（ZFN）”、“類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALEN），成為科研、醫(yī)療等領(lǐng)域的有效工具”.一般通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄得到sgRNA與cas9的mRNA，通過(guò)注射到原核期受精卵內(nèi)，移植到假孕母鼠體內(nèi)獲得基因編輯的小鼠進(jìn)行基因功能研究。
　　
　　構(gòu)建方法：
　　
　　確定待敲除基因的靶位點(diǎn)。
　　
　　設(shè)計(jì)識(shí)別靶位點(diǎn)的識(shí)別的一對(duì)sgRNA。
　　
　　構(gòu)建可表達(dá)sgRNA的Cas9質(zhì)粒。
　　
　　體外轉(zhuǎn)錄sgRNA 和Cas9 RNA。
　　
　　將sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵檢測(cè)sgRNA活性。
　　
　　將有活性的sgRNA和Cas9 RNA直接注射入受精卵建立Founder。
　　
　　將Founder自交得到F1代。
　　
　　適用范圍：
　　
　　制備敲除鼠，利用敲除鼠進(jìn)行基因功能的研究；進(jìn)行細(xì)胞水平敲除基因時(shí)，可以選擇慢病毒載體，構(gòu)建lenticrispr-v2質(zhì)粒，通過(guò)包裝病毒進(jìn)行細(xì)胞水平敲除。
　　
　　基因敲減
　　
　　RNA水平，是指通過(guò)降解具有同源序列靶基因的mRNA，達(dá)到阻止基因表達(dá)的作用。一般用于細(xì)胞水平敲減基因。
　　
　。1）RNA干擾：
　　
　　是siRNA雙鏈結(jié)合一個(gè)核酶復(fù)合物從而形成所謂RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物RISC。激活的RISC通過(guò)堿基配對(duì)定位到同源mRNA轉(zhuǎn)錄本上，并在距離siRNA3’端12個(gè)堿基的位置切割mRNA，該mRNA發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，是一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默。
　　
　　一般合成針對(duì)靶基因的siRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法使之進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，使靶基因沉默。這一方法受轉(zhuǎn)染效率的影響較大。目前有不少基因的siRNA已經(jīng)有商業(yè)產(chǎn)品，所以使用時(shí)買(mǎi)來(lái)就可以了，比較方便。
　　
　　適用范圍：
　　
　　一般通過(guò)公司合成后，通過(guò)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞水平敲減。
　　
　　（2）shRNA：
　　
　　“短發(fā)夾RNA”，shRNA包括兩個(gè)短反向重復(fù)序列，中間由一莖環(huán)（loop）序列分隔的，組成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，由polⅢ啟動(dòng)子控制。隨后再連上5-6個(gè)T作為RNA聚合酶Ⅲ的轉(zhuǎn)錄終止子。
　　
　　構(gòu)建shRNA的病毒表達(dá)載體，常用的病毒載體有腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體、慢病毒載體等，機(jī)制與質(zhì)粒載體相似，利用了病毒感染細(xì)胞效率比較高的特點(diǎn)，解決了用質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的缺陷。
　　
　　構(gòu)建方法：
　　
　　shRNA設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)RNA干擾序列是RNAi實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。
　　
　　載體構(gòu)建：可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇慢病毒、腺病毒載體。
　　
　　轉(zhuǎn)染細(xì)胞：常用的方法包括磷酸鈣轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔轉(zhuǎn)染等
　　
　　觀測(cè)GFP 熒光和穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系篩選：可用于帶有GFP標(biāo)簽的質(zhì)粒載體。
　　
　　檢測(cè)RNA 干擾效率：可以在蛋白水平或mRNA水平檢測(cè)RNA干擾效率。
　　
　　適用范圍：
　　
　　一般通過(guò)構(gòu)建慢病毒、腺病毒等進(jìn)行細(xì)胞水平敲減。