細胞凋亡(Apoptosis)，又稱細胞程序性死亡(PCD: Programmed Cell Death)，是指細胞在一定的生理或病理條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程。它是一個主動的，高度有序的，基因控制的，一系列酶參與的過程。細胞凋亡概念提出至今還不到30年的時間，但由于它在保證多細胞生物的健康生存過程中扮演著關鍵角色，對個體的正常發(fā)育及細胞凋亡紊亂在病理學研究中的重要作用，引起了人們對其機制和組分的廣泛而深入地研究，成為目前生命科學界最為熱門話題之一，也是生命科學界乃至社會各界爭相投入的研究領域。從近年的SCI排名中我們可以看到，信號傳導方面的文章遠遠超過位于第二位的人類基因組方面的，而信號傳導中一個重要的前沿領域就是細胞凋亡的研究。隨著這方面研究的持續(xù)升溫，涌現(xiàn)出了大量新的技術和方法對細胞凋亡進行檢測，其中不少已經(jīng)有商品化的產(chǎn)品出現(xiàn)，大大加速了研究的進程。具體來說，針對凋亡的不同階段有以下一些方法。

　　1. 早期檢測:

　　1) PS(磷脂酰絲氨酸)在細胞外膜上的檢測:

　　PS從細胞膜內(nèi)側轉(zhuǎn)移到外側在細胞受到凋亡誘導后不久發(fā)生, 可能作為免疫系統(tǒng)的識別標志。AnnexinV，一個鈣依賴性的磷脂結合蛋白，能專一性的結合暴露在膜外側的PS，再通過簡單的顯色或發(fā)光系統(tǒng)進行檢測。由于這是一種凋亡早期的活細胞檢測(懸浮細胞和貼壁細胞都適用)，可與DNA染料或別的晚期檢測方法相結合來標記凋亡的發(fā)展階段。

　　美國著名生物試劑公司CLONTECH和INTERGEN公司分別開發(fā)了多種標記的Annexin V產(chǎn)品，簡便快速，10分鐘就可完成檢測。其中帶熒光標記的Annexin V-EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)及Annexin V-FITC，靈敏度高，可作為FACS(流式細胞分選)方法篩選凋亡細胞的基礎。由于融合蛋白Annexin V-EGFP，EGFP與PS 的結合比例為1：1，還可進行定量檢測。除此之外，還提供生物素偶聯(lián)的Annexin V，可通過常用的酶聯(lián)顯色反應來檢測。另外，MACS公司將磁珠包被Annexin V，可采用磁分選方法篩選凋亡細胞。

　　2)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)改變的檢測：

　　這反應了細胞凋亡研究中相對較新的趨勢，研究什么樣的氧化還原環(huán)境引起下游事件的發(fā)生。CLONTECH公司的ApoAlertTM Glutathione Detection Kit通過熒光染料monochlorobimane(MCB)體外檢測凋亡細胞細胞質(zhì)中谷光苷肽的減少來檢測凋亡早期細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的變化。正常狀態(tài)下,谷光苷肽(glutathione：GSH)作為細胞的一種重要的氧化還原緩沖劑。細胞內(nèi)有毒的氧化物通過被GSH還原而定期去除，氧化型的GSH又可被GSH還原酶迅速還原。這一反應在線粒體中尤為重要，許多呼吸作用中副產(chǎn)物的氧化損傷將由此被去除。在Jurcat和一些其它類型的細胞中，細胞膜中有可被凋亡信號啟動的ATP依賴的GSH轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。當細胞內(nèi)GSH的排除非�；钴S時，細胞液就由還原環(huán)境轉(zhuǎn)為氧化環(huán)境，這可能導致了凋亡早期細胞線粒體膜電位的降低，從而使細胞色素C(三羧酸循環(huán)中的重要組分)從線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)移到細胞液中，啟動凋亡效應器caspase的級聯(lián)反應。

　　由于 GSH與氧化還原作用及線粒體功能密切相關，此項檢測除了對研究細胞凋亡的起始非常有用外，還可用于心臟病、中風等疾病治療的研究。但有些細胞如：HeLa 和3T3細胞凋亡時沒有明顯的GSH水平的變化，不能用此法檢測。

　　3)細胞色素C的定位檢測

　　細胞色素C作為一種信號物質(zhì)，在細胞凋亡中發(fā)揮著重要的作用。正常情況下，它存在于線粒體內(nèi)膜和外膜之間的腔中，凋亡信號刺激使其從線粒體釋放至細胞液，結合Apaf-1 (apoptotic protease activating factor-1)后啟動caspase級聯(lián)反應：細胞色素C/Apaf-1復合物激活caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。細胞色素C氧化酶亞單位Ⅳ(cytochrome c oxidase subunit Ⅳ：COX4)是定位在線粒體內(nèi)膜上的膜蛋白，凋亡發(fā)生時，它保留在線粒體內(nèi)，因而它是線粒體富集部分的一個非常有用的標志。

　　ApoAlertTMCell Fractionation Kit不用超離心，可從凋亡和非凋亡細胞中快速有效分離出高度富集的線粒體部分，再進一步通過Western雜交用細胞色素C抗體和COX4抗體標示細胞色素C和COX4的存在位置，從而判斷凋亡的發(fā)生。

　　4) 線粒體膜電位變化的檢測：

　　在凋亡研究的早期，從形態(tài)學觀測上線粒體沒有明顯的變化。隨著凋亡機制研究的深入，發(fā)現(xiàn)線粒體凋亡也是細胞凋亡的重要組成部分，發(fā)生很多生理生化變化。例如，在受到凋亡誘導后線粒體轉(zhuǎn)膜電位會發(fā)生變化，導致膜穿透性的改變。MitoSensorTM，一個陽離子性的染色劑，對此改變非常敏感，呈現(xiàn)出不同的熒光染色。正常細胞中，它在線粒體中形成聚集體，發(fā)出強烈的紅色熒光。凋亡細胞中，因線粒體穿膜電位的改變，它以單體形式存在于細胞液中，發(fā)出綠色熒光。用熒光顯微鏡或流式細胞儀可清楚地分辨這兩種不同的熒光信號。CLONTECH公司的ApoAlert Mitochondrial Membrane Sensor Kit就采用這種原理來檢測線粒體膜電位的變化。但是，這種方法不能區(qū)分細胞凋亡或其他原因?qū)е碌木�粒體膜電位的變化。

　　2. 晚期檢測：

　　細胞凋亡晚期中，核酸內(nèi)切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA，產(chǎn)生大量長度在180-200 bp 的DNA片段。對于這一現(xiàn)象的檢測通常有以下兩種方法：

　　1) TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)

　　通過DNA末端轉(zhuǎn)移酶將帶標記的 dNTP (多為dUTP)間接(通過地高辛)或直接接到DNA片段的3’-OH端，再通過酶聯(lián)顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法，直接熒光標記，地高辛介導熒光標記或過氧化物酶聯(lián)顯色，可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養(yǎng)物等多種樣本的檢測。其中，直接標記步驟少，操作簡便。而間接標記有信號放大的作用，檢測靈敏度高。

　　2) LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)

　　當?shù)蛲黾毎壤^小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時，直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭，專一性地擴增核小體的梯度片段，從而靈敏地檢測凋亡時產(chǎn)生的核小體的梯度片段。此外，LM-PCR 檢測是半定量的，因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。

　　上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征，但細胞受到其它損傷(如機械損傷，紫外線等)也會產(chǎn)生這一現(xiàn)象，因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。

　　3) Telemerase Detection (端粒酶檢測)

　　這是相對來說推出較早，用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白，它可以自身RNA為模板逆轉(zhuǎn)錄合成端粒區(qū)重復序列，使細胞獲得“永生化”。正常體細胞是沒有端粒酶活性的，每分裂一次，染色體的端粒會縮短，這可能作為有絲分裂的一種時鐘，表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發(fā)現(xiàn)，90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze Telemerase Detection Kit在1996年率先推出。它提供特定的寡核苷酸底物，分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性，就能在底物上接上不同個數(shù)的6堿基(GGTTAG)端粒重復序列，通過PCR反應，產(chǎn)物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現(xiàn)象(參見圖4)。此外，Intergen公司還提供用酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.

　　同樣，這種檢測方法也不專對細胞凋亡，檢測結果也不純反應細胞凋亡的發(fā)生。

　　3.mRNA水平的檢測

　　研究者們發(fā)現(xiàn)了很多在細胞凋亡時表達異常的基因，檢測這些特異基因的表達水平也成為檢測細胞凋亡的一種常用方法。據(jù)報道，F(xiàn)as 蛋白結合受體后能誘導癌細胞中的細胞毒性T細胞(cytotoxic T cells)等靶細胞。Bcl-2 和bcl-X (長的) 作為抗凋亡(bcl-2 和bcl-X)的調(diào)節(jié)物，它們的表達水平比例決定了細胞是凋亡還是存活。一般多采用Northern雜交和RT-PCR走膠對它們進行檢測。隨著近年來熒光定量PCR技術的發(fā)展，用定量PCR技術來檢測基因表達水平無疑比之前者更快更準確。Intergen公司的Amplifluor? Apoptosis Gene Systems就根據(jù)這一新技術原理，通過檢測fas, bax-alpha 和 bcl-X (長的) 基因的 mRNA表達水平來進行細胞凋亡的檢測。

　　以上介紹了針對凋亡不同階段特征的檢測方法，隨著凋亡機制研究的深入，近年來還發(fā)展了許多針對特定的凋亡途徑的檢測，如抗體法，酶活性測定等等，Cell Signeling technology公司，DAKO公司，Santa-Cruz公司，Calbiochem & Oncogene公司都緊跟科研潮流，開發(fā)了大量的抗體及活性測定產(chǎn)品。我們將陸續(xù)報道這方面的技術方法與產(chǎn)品。