半連續(xù)式培養(yǎng)

　　1. 半連續(xù)式培養(yǎng)又稱為重復(fù)分批式培養(yǎng)或換液培養(yǎng)。采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)，懸浮培養(yǎng)形式。在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每間隔一段時(shí)間，從中取出部分培養(yǎng)物，再用新的培養(yǎng)液補(bǔ)足到原有體積，使反應(yīng)器內(nèi)的總體積不變。 這種類型的操作是將細(xì)胞接種一定體積的培養(yǎng)基，讓其生長(zhǎng)至一定的密度，在細(xì)胞生長(zhǎng)至最大密度之前，用新鮮的培養(yǎng)基稀釋培養(yǎng)物，每次稀釋反應(yīng)器培養(yǎng)體積的 1/2~3/4，以維持細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，隨著稀釋率的增加培養(yǎng)體積逐步增加�；蛘咴诩�(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，每隔一定時(shí)間，定期取出部分培養(yǎng)物，或是條件培養(yǎng)基，或是連同細(xì)胞、載體一起取出，然后補(bǔ)加細(xì)胞或載體，或是新鮮的培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)的一種操作模式。剩余的培養(yǎng)物可作為種子，繼續(xù)培養(yǎng)，從而可維持反復(fù)培養(yǎng)，而無(wú)需反應(yīng)器的清洗、消毒等一系列復(fù)雜的操作。在半連續(xù)式操作中由于細(xì)胞適應(yīng)了生物反應(yīng)器的培養(yǎng)環(huán)境和相當(dāng)高的接種量，經(jīng)過(guò)幾次的稀釋、換液培養(yǎng)過(guò)程，細(xì)胞密度常常會(huì)提高。

　　2.半連續(xù)式特點(diǎn)：

　　●培養(yǎng)物的體積逐步增加;

　　●可進(jìn)行多次收獲;

　　●細(xì)胞可持續(xù)指數(shù)生長(zhǎng)，并可保持產(chǎn)物和細(xì)胞在一較高的濃度水平，培養(yǎng)過(guò)程可延續(xù)到很長(zhǎng)時(shí)間。 該操作方式的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便，生產(chǎn)效率高，可長(zhǎng)時(shí)期進(jìn)行生產(chǎn)，反復(fù)收獲產(chǎn)品，可使細(xì)胞密度和產(chǎn)品產(chǎn)量一直保持在較高的水平。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)和藥品生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用。

　　連續(xù)式培養(yǎng)

　　1. 連續(xù)式培養(yǎng)是一種常見的懸浮培養(yǎng)模式，采用機(jī)械攪拌式生物反應(yīng)器系統(tǒng)。該模式是將細(xì)胞接種與一定體積的培養(yǎng)基后，為了防止衰退期的出現(xiàn)，在細(xì)胞達(dá)最大密度之前，以一定速度向生物反應(yīng)器連續(xù)添加新鮮培養(yǎng)基;同時(shí)，含有細(xì)胞的培養(yǎng)物以相同的速度連續(xù)從反應(yīng)器流出，以保持培養(yǎng)體積的恒定。理論上講，該過(guò)程可無(wú)限延續(xù)下去。

　　2.連續(xù)培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是反應(yīng)器的培養(yǎng)狀態(tài)可以達(dá)到恒定，細(xì)胞在穩(wěn)定狀態(tài)下生長(zhǎng)。穩(wěn)定狀態(tài)可有效的延長(zhǎng)分批培養(yǎng)中的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。在穩(wěn)定狀態(tài)下細(xì)胞所處的環(huán)境條件如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)濃度、產(chǎn)物濃度、pH值可保持恒定，細(xì)胞濃度以及細(xì)胞比生長(zhǎng)速率可維持不變。細(xì)胞很少受到培養(yǎng)環(huán)境變化帶來(lái)的生理影響，特別是生物反應(yīng)器的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)葡萄糖和谷氨酰胺，維持在一個(gè)較低的水平，從而使他們的利用效率提高，有害產(chǎn)物積累有所減少。然而在高的稀釋率下，雖然死細(xì)胞和細(xì)胞碎片及時(shí)清除，細(xì)胞活性高最終細(xì)胞密度得到提高;可是產(chǎn)物卻不斷在稀釋，因而產(chǎn)物濃度并為提高;尤其是細(xì)胞和產(chǎn)物不斷的稀釋，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率、細(xì)胞增長(zhǎng)速率和產(chǎn)物生產(chǎn)速率低下。

　　3.連續(xù)式培養(yǎng)不足：

　　●由于是開放式操作，加上培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，容易造成污染;

　　●在長(zhǎng)周期的連續(xù)培養(yǎng)中，細(xì)胞的生長(zhǎng)特性以及分泌產(chǎn)物容易變異;

　　●對(duì)設(shè)備、儀器的控制技術(shù)要求較高。 連續(xù)式培養(yǎng)操作使用的反應(yīng)器多數(shù)是攪拌式生物反應(yīng)器，也可以是管式反應(yīng)器。

　　4.連續(xù)式培養(yǎng)的特點(diǎn)：

　　●細(xì)胞維持持續(xù)指數(shù)增長(zhǎng);

　　●產(chǎn)物體積不斷增長(zhǎng);

　　●可控制衰退期與下降期。

　　灌流式培養(yǎng)

　　1. 灌流式培養(yǎng)是把細(xì)胞和培養(yǎng)基一起加入反應(yīng)器后，在細(xì)胞增長(zhǎng)和產(chǎn)物形成過(guò)程中，不斷地將部分條件培養(yǎng)基取出，同時(shí)又連續(xù)不斷地灌注新的培養(yǎng)基。它與半連續(xù)式操作的不同之處在于取出部分條件培養(yǎng)基時(shí)，絕大部分細(xì)胞均保留在反應(yīng)器內(nèi)，而半連續(xù)培養(yǎng)在取培養(yǎng)物時(shí)同時(shí)也取出了部分細(xì)胞。 灌流式培養(yǎng)常使用的生物反應(yīng)器主要有兩種形式。一種是用攪拌式生物反應(yīng)器懸浮培養(yǎng)細(xì)胞，這種反應(yīng)器必須具有細(xì)胞截流裝置，細(xì)胞截留系統(tǒng)開始多采用微孔膜過(guò)濾或旋轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)，最近開發(fā)的有各種形式的沉降系統(tǒng)或透析系統(tǒng)。 中空纖維生物反應(yīng)器是連續(xù)灌流操作常用的一種。它采用的中空纖維半透膜，透過(guò)小分子量的產(chǎn)物和底物，截流細(xì)胞和分子量較大的產(chǎn)物，在連續(xù)灌流過(guò)程中將絕大部分細(xì)胞截留在反應(yīng)器內(nèi);近年來(lái)中空纖維生物反應(yīng)器被廣泛應(yīng)用于產(chǎn)物分泌性動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)，主要用于培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)單克隆抗體。 另外一種形式是固定床或流化床生物反應(yīng)器，固定床是在反應(yīng)器中裝配固定的籃筐，中間裝填聚脂纖維載體，細(xì)胞可附著在載體上生長(zhǎng)，也可固定在載體纖維之間，靠上攪拌中產(chǎn)生的負(fù)壓，迫使培養(yǎng)基不斷流經(jīng)填料，有利于營(yíng)養(yǎng)成分和氧的傳遞，這種形式的灌流速度較大，細(xì)胞在載體中高密度生長(zhǎng)。流化床生物反應(yīng)器是通過(guò)流體的上升運(yùn)動(dòng)使固體顆粒維持在懸浮狀態(tài)進(jìn)行反應(yīng)，適合于固定化細(xì)胞的培養(yǎng)。

　　2.灌流式培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)：

　　●細(xì)胞截流系統(tǒng)可使細(xì)胞或酶保留在反應(yīng)器內(nèi)，維持較高的細(xì)胞密度，一般可達(dá)107-109/ml，從而較大的提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量;

　　●連續(xù)灌流系統(tǒng)，使細(xì)胞穩(wěn)定的處在較好的的營(yíng)養(yǎng)環(huán)境中，有害代謝廢物濃度積累較低;

　　●反應(yīng)速率容易控制，培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，可提高生產(chǎn)率，目標(biāo)產(chǎn)品回收率高;

　　● 產(chǎn)品在罐內(nèi)停留時(shí)間短，可及時(shí)回收到低溫下保存，有利于保持產(chǎn)品的活性。 連續(xù)灌注培養(yǎng)是近年用于動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應(yīng)用連續(xù)灌流工藝的公司有 Genzyme, Genetic Institute, Bayer公司等。這種方法最大困難是污染機(jī)率較高，長(zhǎng)期培養(yǎng)中細(xì)胞分泌產(chǎn)品的穩(wěn)定性，規(guī)模放大過(guò)程中工程問(wèn)題。

　　細(xì)胞工廠培養(yǎng)

　　細(xì)胞工廠(cell factory)是一種設(shè)計(jì)精巧的細(xì)胞培養(yǎng)裝置。它在有限的空間內(nèi)利用了最大限度的培養(yǎng)表面，從而節(jié)省了大量的廠房空間,并可節(jié)省貴重的培養(yǎng)液。更重要的是，它可有效地保證操作的無(wú)菌性，從而避免因污染而帶來(lái)的原料、勞務(wù)和時(shí)間損失。它是對(duì)傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的革命。 丹麥NUNC公司生產(chǎn)的NUNC細(xì)胞工廠是目前應(yīng)用較多的細(xì)胞工廠系統(tǒng)。可用于如疫苗、單克隆抗體或生物制藥等工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)，特別適合于貼壁細(xì)胞，也可用于懸浮培養(yǎng)，在從實(shí)驗(yàn)室規(guī)模進(jìn)行放大時(shí)不會(huì)改變細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)條件，可提供1，2，10和40盤的規(guī)格使放大變得簡(jiǎn)單易行，低污染風(fēng)險(xiǎn)，節(jié)省空間，培養(yǎng)表面經(jīng)測(cè)試保證最有利于細(xì)胞貼附和生長(zhǎng)。同時(shí)，與NUNC的細(xì)胞工廠操作儀結(jié)合使用，可全面實(shí)現(xiàn)細(xì)胞培養(yǎng)的自動(dòng)化，從而大大地減低勞動(dòng)強(qiáng)度和密集度。 這套系統(tǒng)使用很方便，可產(chǎn)生類似塑料培養(yǎng)瓶的效果。由組織培養(yǎng)級(jí)聚笨乙烯制成，使用后可隨意處理。其最大缺點(diǎn)是：經(jīng)胰酶消化后，很難將細(xì)胞完全洗出。