分類和進化研究是生物學中最古老的領(lǐng)域之一。過去的研究主要依靠生物體的形態(tài)，并輔以生理特征，來探討生物間親緣關(guān)系的遠近，有人稱之為經(jīng)典的方法，它是一百多年來完成微生物分類的主要方法。經(jīng)典的方法是隨機的和不系統(tǒng)的，只適用于一些形態(tài)復雜的真核生物和較大的原核生物�，F(xiàn)在，由于生物技術(shù)的不斷完善，人類對自然界的認識水平不斷地提高，就對以前的一些研究方法以及研究結(jié)果提出了質(zhì)疑。如長久以來，生物界被劃分為原核、真核兩大界，認為真核生物由原始的原核生物進化而來。但隨著對原核生物各類群的研究的深入，卻發(fā)現(xiàn)許多生活在極端環(huán)境(高鹽、高溫、極端pH值)的古細菌(Archaebacteria)在生理生化諸多方面與一般的真細菌存在巨大差異，其分子機制亦相當獨特。那么，這類古細菌是否應當從原核生物中獨立出來而自成一個體系呢？近年來，由于分子生物學的迅速發(fā)展和廣泛應用，特別是蛋白質(zhì)和核酸序列研究的突破性進展，使微生物系統(tǒng)分類的基礎(chǔ)發(fā)生了重大的變化，分類系統(tǒng)已經(jīng)或正在隨著分子標準的不斷滲入而完善。所謂分子標準主要是指建立在DNA分析技術(shù)基礎(chǔ)上的分類方法。與表型特征相比較，核酸序列在生物體的進化過程中較少受到環(huán)境的影響，因而更能反映出生物體在演變進化過程中的本質(zhì)，其研究結(jié)論也更可靠。這樣，人們就將系統(tǒng)進化研究從宏觀逐漸轉(zhuǎn)向微觀，并把宏觀和微觀的特征結(jié)合起來，以便更準確地反映生物體間真正的進化關(guān)系。

　　早期的分子標準主要建立在諸如DNA堿基比例測定或核酸分子雜交等基礎(chǔ)上。我們知道，每一種生物體均有其特有的、穩(wěn)定的核酸成分和結(jié)構(gòu)；不同生物間核酸成分和結(jié)構(gòu)的差異程度代表著它們之間親緣關(guān)系的遠近。由此，從核酸分子水平來研究生物的進化關(guān)系就成為分類學的一個新途徑，微生物分類學也不例外。最早在1956年由Lee等提出了DNA堿基比例的測定方法。DNA堿基比例主要是指“G+Cmol％"比例，即鳥嘌呤(G)和胞嘧啶(C)在整個DNA中的摩爾百分比。不同種的微生物，其4種堿基的含量及排列順序不同，因此G+Cmol％比例一般會隨種的不同而有變化。一般來說，G+Cmol％差異愈大，分類地位愈疏遠。而G+Cmol％比例相似，可能屬于同種，也可能不是同種，因為堿基成分相似的DNA可能有很多種堿基順序。例如，螺菌屬(Spirillum)的G+Cmol％比例是38％～65％，輻度過寬。后來根據(jù)其堿基成分和其他特征的不同已被劃分成3屬：螺菌屬(Spirillum，38％)、海洋螺菌屬(Oceanspirillum，42％～48％)和水生螺菌屬(Aquaspirillum，50％～56％)。

　　如前所述，測定DNA的G+Cmol％比例只能確定含量不同的細菌為不同的種，而不能確定含量相近的細菌必然屬于同一個種。若要進一步確定，還必須借助其他方法，例如核酸分子雜交方法。研究DNA-DNA或DNA-RNA雜交最方便的方法，就是采用來自一個菌株的放射性核酸與來自另一個菌珠的非放射性核酸，經(jīng)熱變性之后，把兩種核酸樣品混合，使其復性，測定放射性結(jié)合鍵的百分率。百分率越高，說明兩者堿基順序的同源性越高，亦即親緣關(guān)系越近。核酸分子雜交技術(shù)對解決種水平上的分類學問題和確定新種是十分有效的。

　　從20世紀70年代初起，16S rRNA序列分析成為細菌分類的一個重要指標。16SrRNA分子具高度的保守性，在30多億年的進化中仍保持著原初的狀態(tài)，因此可用作探索自古至今生物的主要進化歷程，是一種理想的研究材料。1977年，Woese等人測定了200多種原核生物的16SrRNA和真核生物的18SrRNA的寡核苷酸順序譜，經(jīng)比較研究，不但搞清了原核生物和真核生物的許多系統(tǒng)進化問題，而且還以此為根據(jù)提出了生命體系的三界學說，引起了生物學家的普遍關(guān)注，并由此而引發(fā)了研究古細菌的熱潮。16SrRNA寡核苷酸順序分析所依據(jù)的基本原理是這樣的，用可專一性地水解G(鳥嘌呤)上3′端磷酸酯鍵的核糖核酸酶水解提純的rRNA，產(chǎn)生一系列以G為結(jié)尾的長度不一的寡核苷酸片段，一一測定其核苷酸序列，最后把它們編成一部“詞典"。兩個菌株rRNA的相似性就可通過查閱“詞典"來作比較。但這種方法在當時是一項工作量大，實驗條件復雜和操作要求十分嚴格的分析技術(shù)，因此其應用仍然受一定的限制。

　　80年代中期，聚合酶鏈反應(PCR)的出現(xiàn)和完善，以及利用PCR擴增產(chǎn)物進行堿基序列分析方法的出現(xiàn)，使迅速得到特定DNA片段的遺傳信息成為現(xiàn)實，這樣就使得人們可以用完整而不是部分的DNA序列來判斷生物之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。1996年8月，《SCIENCE》發(fā)表了美國TICR(The Institute for Genomic Research)研究所的最新學術(shù)成果---產(chǎn)甲烷球菌的全基因組序列。這是自Woese提出三界學說以來測定的第一個古核生物(Archaea)的全基因組序列，從而為古核生物的研究提供了充分的序列材料。TIGR給出了產(chǎn)甲烷球菌的1738個基因的定位，經(jīng)同源性搜索和GENEMARK的基因定位方法研究，結(jié)果表明，約有58％的基因在現(xiàn)有生物的基因數(shù)據(jù)庫中找不到同源序列。這足以說明產(chǎn)甲烷球菌上有著大量的新基因序列，從而為三界學說的建立和發(fā)展找到了堅實的證據(jù)。

　　在國內(nèi)，利用PCR技術(shù)研究系統(tǒng)進化問題尚處起步階段。周培瑾、徐毅等人自1994年起首先開展了這方面的工作。他們用PCR技術(shù)擴增了嗜鹽菌的16SrRNA；并在此基礎(chǔ)上將一株從新疆鹽湖分離到的嗜鹽菌B2菌株進行了16SrRNA核苷酸序列分析；最后通過比較它與嗜鹽菌各屬中其他種的16SrRNA序列的相互關(guān)系，鑒定B2菌株為嗜鹽小盒菌屬的一個新種。他們的工作在國內(nèi)，特別是嗜鹽菌的系統(tǒng)發(fā)育研究方面尚屬首次。

　　利用PCR方法研究系統(tǒng)進化一般要進行以下程序：
　　(1)樣品來源及模板制備 用以抽提模板DNA的樣品只需極少量，且模板用量也極低，只需幾個納克(新鮮樣品)，抽提過程較為簡單，可用經(jīng)典的DNA或RNA提取法。
　　(2)對稱PCR 根據(jù)選用的引物來擴增模板DNA的特異性雙鏈片段。這個過程引物的設計至關(guān)重要。若設計不合理，擴增出非特異性片段，則會導致錯誤的推斷。一般來說，引物應位于待分析基因組中的高度保守區(qū)域，長度以15～30hp為宜。
　　(3)不對稱PCR 利用對稱PCR的雙鏈產(chǎn)物作為其擴增的模板DNA，控制兩種引物的用量之比為1∶50或1∶100，就可根據(jù)單引物來擴增出特異性的單鏈DNA。
　　(4)堿基序列測定 利用單鏈DNA產(chǎn)物進行堿基序列分析。這項工作因自動測序儀的出現(xiàn)而變得簡單易行。
　　(5)DNA序列數(shù)據(jù)分析 通過PCR得到特異性DNA片段的堿基序列只是進化研究工作中的一個中間環(huán)節(jié)，最終還必須對這些數(shù)據(jù)進行分析推斷，對序列數(shù)據(jù)分析的方法很多。

　　目前，PCR技術(shù)在系統(tǒng)進化研究中得到廣泛應用，PCR途徑對模板DNA的純度要求不高，所需樣品量也極低，這就為抽提過程簡單化創(chuàng)造了條件�？芍苯拥玫胶塑账岬恼鎸嵭蛄�。這樣，通過序列之間的直接比較，就更能說明問題，所得結(jié)果也更可靠。另外，在原有PCR技術(shù)基礎(chǔ)上結(jié)合各種生化分子生物學技術(shù)，還衍生了許多改良技術(shù)，大大方便了這方面的研究工作。如PCR-SSCP是最近發(fā)展起來的一種非同位素、快速、簡便、靈敏度高的檢測基因突變的新技術(shù)，目前被廣泛應用于篩選DNA點突變。再如PCR-RAPD可通過任意選擇一個或二個引物，對基因組DNA進行擴增。擴增產(chǎn)物可經(jīng)1.5％～2％瓊脂糖電泳或在擴增的同時摻入32P，然后經(jīng)6％變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，放射自顯影得到DNA指紋圖譜。其他還有諸如PCR定量檢測技術(shù)、PCR-RELP等等。另外，繼PCR擴增技術(shù)之后，又有一種新的核酸擴增技術(shù)---NASBA技術(shù)問世了。它與PCR不同的是：PCR技術(shù)要求有3個不同的溫度，而NASBA只需在一種溫度下就可以完成反應；NASBA的核酸擴增效率甚至比PCR的擴增效率還要高，2小時內(nèi)目的基因可以擴增109倍；更主要的是NASBA能直接擴增單鏈RNA上的特異序列，這對RNA的研究意義非常重大。相信這項新技術(shù)的出現(xiàn)和廣泛應用將大大加快各領(lǐng)域中的各項研究。

　　總之，現(xiàn)代分子生物學技術(shù)的迅速發(fā)展，給系統(tǒng)進化研究帶來了越來越多的便利和可靠性，隨之也推動了微生物系統(tǒng)發(fā)育學的建立和發(fā)展。據(jù)報道，在不遠的將來，以表型為主的分類體系將發(fā)生大的變化，從而能更精確地反映微生物間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。