隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅猛發(fā)展及在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的普及，以RNA為研究對象的實驗與日俱增。RNA質(zhì)量的好壞直接關(guān)系到后續(xù)實驗的成敗。Northern印跡雜交分析、寡聚(Oligdt) 纖維素選擇分離mRNA、cDNA合成及體外翻譯等實驗的成敗，在很大程度上取決于RNA的質(zhì)量。因此在進(jìn)行這些實驗之前對RNA的質(zhì)量進(jìn)行快速可靠的鑒定就十分必要。目前RNA 的質(zhì)量采用變性瓊脂糖凝膠電泳方法來鑒定，這些方法步驟繁瑣、費時、費力。我室在長期進(jìn)行RNA的研究中，摸索出了一套穩(wěn)定、快速和可靠的鑒定RNA質(zhì)量的方法，現(xiàn)報道如下。

　　1.材料與方法

　　1.1.主要試劑：提取RNA的TriPure Isolation Reagent試劑盒、DEPC，常規(guī)試劑如瓊脂糖等為進(jìn)口或國產(chǎn)AR級以上。

　　1.2.RNA的提取：以人胎盤組織提取總RNA，方法按TriPure Isolation Reagent試劑盒說明書進(jìn)行。對提取的RNA在紫外分光光度計上測A260值和A260/ A280比值，確定所提取RNA 的濃度和純度。

　　1.3.RNA的瓊脂糖凝膠電泳：電泳方法、步驟大體同文獻(xiàn)中的瓊脂糖凝膠電泳。為最大限度降低RNA在電泳時被降解，結(jié)合甲醛變性瓊脂凝膠電泳分離RNA方法，在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上進(jìn)行如下改進(jìn)。①電泳RNA所用器械如制膠的模具、梳子、電泳槽等用肥皂粉洗干凈后用雙蒸水沖洗二遍后在室溫晾干備用。②用新的1XTBE配制1.2%瓊脂糖凝膠，倒膠時溴化乙錠(EB)直接加入凝膠中。③制備好的瓊脂糖凝膠板放入電泳槽后再加入經(jīng)高壓滅菌過的1XTBE，液面只能剛好同膠面平齊，緩沖液不要淹過膠面。④點樣時，樣品RNA每10μl加入2μl上樣緩沖液，上樣緩沖液是用DEPC處理的水配制的50 %甘油，另外單獨點一樣品孔含有3μl溴酚藍(lán)的上樣緩沖液作為電泳指示劑，電泳電壓4V/cm，電泳時間2h左右便可取出凝膠在紫外燈下觀看所提取的RNA的質(zhì)量或進(jìn)行拍照記錄。

　　2.結(jié)果：取人胎盤組織RNA3μg和6μg，按本方法以1.2 %的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，可見28S、18S、5.8S(5S)三條清晰的rRNA條帶。

　　3.討論：RNA作為分子生物學(xué)的主要研究對象之一，但它極易受到RNase的水解，在進(jìn)行RNA操作時主要是避免外源RNase的污染，特別是在得到RNA沉淀以后，無RNase抑制劑存在的條件下尤其如此。因此，在RNA操作過程中必須對所有實驗材料進(jìn)行徹底的處理，滅活RNase，如EP管、Tip頭等；另外，有一個良好的操作環(huán)境也是非常的重要。

RNA質(zhì)量如何、是否被降解通常采用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳方法來鑒定。此電泳的主要目的之一是為了Northern blot之用。但在RNA的其他用途中，如cDNA合成和寡聚(OligdT) 纖維素選擇分離mRNA等實驗中要對RNA進(jìn)行質(zhì)量鑒定，此方法就現(xiàn)得繁瑣、費時、費力，而用常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳RNA會水解而達(dá)不到鑒定的目的，如果用本研究改進(jìn)的1.2 %瓊脂糖凝膠方法電泳鑒定，簡單、高效、經(jīng)濟(jì)實用，并且能達(dá)到同用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳相同的實驗結(jié)果。因此本方法在常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳的基礎(chǔ)上所作的每一項改進(jìn)均是為了避免RNA在電泳過程中被水解，比如對所有電泳器具徹底的清洗處理就是為了盡量清除器具上存在的RNase；在RNA樣品中加入用DEPC水配制的50%甘油作為上樣緩沖液，目的也是為了在RNA樣品中避免加入其他試劑時造成RNase的污染。

　　在提取的真核細(xì)胞總RNA中核糖體RNA(rRNA)是28S清晰的帶型，通常認(rèn)為所提取的RNA 未被降解，可以用提取的RNA進(jìn)行后續(xù)實驗。我們實驗室還提取過多種組織RNA如外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA等，經(jīng)此方法鑒定的RNA的質(zhì)量同分子克隆手冊等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA完全無異，結(jié)果穩(wěn)定可靠。占總RNA 的90%以上，它們主要由28S、18 S、5.8 S、5S組成，28S(約4.5 kb)、18S(約2.1kb)、5.8S(5S) 這三類rRNA的摩爾濃度大致相等，但他們的分子量相差較大，在紫外燈下的亮度依次為28S>18S>5.8S(5S)。在電泳后能觀察到28S、18S、5.8 S(5S) ，特別是28S清晰的帶型，通常認(rèn)為所提取的RNA未被降解，可以用提取的RNA進(jìn)行后續(xù)實驗。我們實驗室還提取過多種組織RNA如外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)后的RNA、脂肪組織RNA、肝臟RNA等，經(jīng)此方法鑒定的RNA的質(zhì)量同分子克隆手冊等參考書用變性瓊脂糖凝膠鑒定的RNA完全無異，結(jié)果穩(wěn)定可靠。