病毒包裝是生物醫(yī)學(xué)研究中的一大利器。通過病毒我們可以高效地讓我們要研究的基因在目標(biāo)細(xì)胞中過表達(dá)或者特異性地敲低細(xì)胞中的目標(biāo)基因�？蒲兄杏玫降牟《局饕新《�、腺病毒、腺相關(guān)病毒。根據(jù)各種病毒不同的特性，不同的課題需要包裝不同的病毒。比如，腺相關(guān)病毒更適合進(jìn)行動(dòng)物在體研究。腺病毒具有包裝容量大、適合在體研究等有點(diǎn)。

生物醫(yī)學(xué)科研中使用得最多的是慢病毒，慢病毒具有外源基因容量大、目的基因整合穩(wěn)定表達(dá)、可同時(shí)感染分裂和非分裂細(xì)胞、轉(zhuǎn)染效率高的特點(diǎn)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科研、臨床研究中。

1、預(yù)實(shí)驗(yàn)的重要性

文獻(xiàn)報(bào)道或他人經(jīng)驗(yàn)中的MOI（感染復(fù)數(shù)，毒粒與被感染細(xì)胞的數(shù)量比值），不僅取決于病毒對(duì)細(xì)胞本身的親噬性，而且受到不同來源重組病毒滴度測(cè)定誤差、使用保存過程損失、具體細(xì)胞狀態(tài)、傳代次數(shù)、細(xì)胞密度、具體實(shí)驗(yàn)操作等方面的影響。完全照搬MOI可能并不能達(dá)到最佳效果。

傳代細(xì)胞系、原代細(xì)胞等材料，實(shí)際狀態(tài)在各個(gè)實(shí)驗(yàn)室也會(huì)存在一定差異。預(yù)實(shí)驗(yàn)的目的是找出能夠達(dá)到最高感染效率、同時(shí)細(xì)胞狀態(tài)未受到明顯影響的一個(gè)恰當(dāng)病毒用量。

2、預(yù)實(shí)驗(yàn)安排

設(shè)置不同MOI值的感染組。可設(shè)立5、10、20、50的感染復(fù)數(shù)梯度，各兩孔，一孔加入終濃度為5 ug/ml的polybrene，另一孔不加。如果只需通過熒光顯微鏡觀察，則使用96孔板即可。如需做Real-time PCR或流式檢測(cè)則至少使用24孔板。在6 h、12 h、24h左右觀察總結(jié)感染細(xì)胞狀態(tài)，在72 h左右檢測(cè)感染效率及表達(dá)水平。如為RNAi需檢測(cè)蛋白水平下調(diào)可進(jìn)一步延遲24 h。

如果有文獻(xiàn)報(bào)道的MOI值，可使用該值的0.5x、1x、2x、4x進(jìn)行測(cè)試。如使用較難感染的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，建議設(shè)置易感染細(xì)胞組如293、Hela、A549等作為陽性對(duì)照。

為了便于實(shí)驗(yàn)應(yīng)用，且培養(yǎng)體系中的實(shí)際細(xì)胞數(shù)量存在計(jì)數(shù)誤差，用量預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)論可總結(jié)為一定培養(yǎng)規(guī)模（如96孔板、6孔板）下、一定細(xì)胞密度時(shí)（如60%）、原始毒液加入體積（如5 μl）。當(dāng)需要放大或縮小實(shí)驗(yàn)體系時(shí)，可根據(jù)培養(yǎng)面積（對(duì)應(yīng)細(xì)胞數(shù)）按比例換算得出病毒用量。

3、感染方法（以24孔板為例）

第一天，準(zhǔn)備感染細(xì)胞。在24孔板中接種目的細(xì)胞約5x10⁴/孔，每孔培養(yǎng)基體積0.5 ml。目的細(xì)胞的狀態(tài)對(duì)于感染及表達(dá)非常重要。第二天，凍存待用的病毒于冰上融化，如需稀釋毒液可以用培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋（基礎(chǔ)培養(yǎng)基或完全培養(yǎng)基均可，血清、雙抗不影響病毒感染）。觀察前一天準(zhǔn)備的細(xì)胞，狀態(tài)良好，進(jìn)行病毒感染時(shí)細(xì)胞的匯合度約為50-60%左右。

按滴度計(jì)算毒液所需的用量。如原始滴度為1x10⁸ TU /ml，每孔擬病毒用量為0.5x10⁶ TU，則需要使用原液5 ul。將所需用量的毒液加入完全培養(yǎng)基（500ul）、混勻，吸除孔板中原培養(yǎng)基，加入混合毒液的培養(yǎng)基。放于二氧化碳培養(yǎng)箱（37℃、5%CO₂）孵育培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)更換培養(yǎng)基，如狀態(tài)良好可在12-16h更換培養(yǎng)基，病毒孵育時(shí)間不短于4 h。需要使用polybrene時(shí)，在孵育培養(yǎng)基中先于毒液加入例如5 μg/ml終濃度的polybrene混勻。

按照正常培養(yǎng)基條件繼續(xù)培養(yǎng)48-72 h后可檢測(cè)感染效率。在倒置熒光顯微鏡觀察熒光，估計(jì)慢病毒感染目的細(xì)胞的效率。如載體未攜帶標(biāo)記基因的，可以通過Real-time PCR檢測(cè)目的基因表達(dá)。慢病毒表達(dá)產(chǎn)物在72-96 h左右接近高峰，如細(xì)胞生長(zhǎng)代謝緩慢需適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞在48 h即可觀察基因表達(dá)。

4、實(shí)驗(yàn)參考信息

（1） 常用細(xì)胞系參考MOI值

（2）常用培養(yǎng)器皿使用參數(shù)