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無菌檢測(cè)，無懼超級(jí)抗生素！---賽多利斯實(shí)驗(yàn)室

[2019/4/12]

無菌檢測(cè)，無懼超級(jí)抗生素！---賽多利斯實(shí)驗(yàn)室
開展以下試驗(yàn)是用于證明Sterisart®系統(tǒng)在過濾完硫酸多粘菌素B后，仍可以讓微生物在其中正常生長(zhǎng)。
實(shí)驗(yàn)背景
在沒有抑制劑的情況下，微生物可以快速增殖。在培養(yǎng)基加入系統(tǒng)之前，可能存在于無菌檢測(cè)藥品樣品中的任何防腐劑或抗生素殘留物都必須被沖洗去除。由于多粘菌素不能被中和，所有與樣品接觸的部件必須為低吸附，且所采用的設(shè)計(jì)形式必須保證能夠?qū)崿F(xiàn)徹底沖洗從而去除所有殘留。
試驗(yàn)描述
Sterisart® 系統(tǒng)經(jīng)無菌生理鹽水潤(rùn)濕后，對(duì)硫酸多粘菌素B溶液進(jìn)行過濾。在完成沖洗步驟之后，根據(jù)歐洲藥典要求，將硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基加入Sterisart® 系統(tǒng)的一個(gè)容器內(nèi)。向這個(gè)容器內(nèi)接種50-100CFU微生物，進(jìn)行微生物培養(yǎng)，最多培養(yǎng)3天。
 
材料和設(shè)備
抗生素硫酸多粘菌素B 批號(hào)：A 1411058
檢測(cè)菌株 
綠膿桿菌 
硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基 
NaCl
Merck;
泵
Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵
Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵
Sterisart® 裝置
Sterisart® NF,
Sterisart® NF適配器
檢測(cè)準(zhǔn)備
1
無菌生理鹽水
為制備0.9%的無菌生理鹽水溶液，先將9g固體NaCl溶解于1L去離子水中，裝入帶有隔膜的瓶中，制備2L。然后對(duì)配制完成的溶液進(jìn)行121°C、40分鐘的高壓蒸汽滅菌
2
抗生素溶液的溶解(20 g/L)
2.1  背景
抗生素的溶解是無菌檢測(cè)操作中非常關(guān)鍵的操作步驟。未溶解的殘留抗生素會(huì)被膜過濾器截留，導(dǎo)致培養(yǎng)過程中抑制微生物生長(zhǎng)。試驗(yàn)表明使用30°C的生理鹽水溶解硫酸多粘菌素B最為迅速可靠。更為詳細(xì)的試驗(yàn)描述和試驗(yàn)結(jié)果請(qǐng)參考Sterisart® 應(yīng)用指南No.1。針對(duì)下一步驟，我們還專門開發(fā)了一種注入和搖勻的方法。生理鹽水的預(yù)熱可通過培養(yǎng)箱或水浴輕松實(shí)現(xiàn)。
2.2  樣品制備
取事先準(zhǔn)備好一個(gè)帶有隔膜的500ml瓶(瓶A)， 內(nèi)含10g抗生素混合物。將Sterisart® NF適配器16470的無標(biāo)識(shí)管路插入泵中，然后將16470帶有黃色標(biāo)記的長(zhǎng)針頭插入瓶B的隔膜中，該瓶?jī)?nèi)裝有500ml已預(yù)熱至30°C的無菌生理鹽水；進(jìn)而將短針頭插入裝有抗生素的瓶A的隔膜中。瓶A以一定角度倒置，使
抗生素凍干粉落到瓶頸處。然后將NaCl溶液以設(shè)定值為300的泵速打入裝有抗生素的瓶A中。


大約5秒鐘后，將瓶A恢復(fù)正位，讓抗生素和NaCl溶液一起回落到瓶底。流體的泵入壓力要足以將粘在玻璃瓶壁上的抗生素沖洗下來。向瓶A注入溶液到500ml刻度，然后搖動(dòng)瓶子直至抗生素完全溶解。以上操作步驟使用了貨號(hào)為16470的Sterisart®NF適配器和貨號(hào)為16413的Sterisart®通用型無菌檢測(cè)泵，該泵是現(xiàn)有16420無菌檢測(cè)泵的上一代產(chǎn)品。有關(guān)Sterisart® NF 適配器16470使用的詳細(xì)信息見產(chǎn)品說明書。
 試驗(yàn)方法
膜過濾
將Sterisart® 系統(tǒng)16466裝入泵中后，向系統(tǒng)泵入100ml無菌生理鹽水，用于潤(rùn)濕濾膜。然后向Sterisart® 系統(tǒng)中泵入無菌空氣以排空溶液。隨后，500ml溶解好的抗生素經(jīng)容器濾過。需特別當(dāng)心，避免抗生素液體沾到后續(xù)無法沖洗到的區(qū)域。再次用無菌空氣排空裝置。隨后用5×200ml無菌生理鹽水沖洗濾膜，以確保無抗生素殘留在膜和塑料部件上，從而不會(huì)抑制微生物的生長(zhǎng)。有關(guān)Sterisart®NF裝置的詳細(xì)使用信息見所附產(chǎn)品說明書。
注入培養(yǎng)基
將100ml硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基注入Sterisart® 系統(tǒng)兩個(gè)容器中的一個(gè)。用夾子將管路夾緊封好，在距夾子約10cm處切斷管路。第二個(gè)容器用于進(jìn)一步檢測(cè)。
接種微生物
硫酸多粘菌素B適用于多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌。因此試驗(yàn)使用綠膿桿菌(革蘭氏陰性菌)。通過系列稀釋方式確保每ml綠膿桿菌溶液中含50-100CFU菌。取
1.0ml綠膿桿菌溶液加入硫乙醇酸鹽液體培養(yǎng)基中。
培養(yǎng)
Sterisart® 容器在30 °C條件下培養(yǎng)3天。每天檢查微生物的生長(zhǎng)情況。
結(jié)果
培養(yǎng)48h后，可明顯觀察到微生物在Sterisart® 容器內(nèi)生長(zhǎng)。培養(yǎng)基非常渾濁（生長(zhǎng)情況良好）。


結(jié)論
使用5×200ml生理鹽水沖洗即可確保抗生素的有效去除。微生物生長(zhǎng)試驗(yàn)結(jié)果表明測(cè)試所用硫酸多粘菌素B在Sterisart®系統(tǒng)內(nèi)沒有殘留，不存在促進(jìn)或抑制微生物生長(zhǎng)效應(yīng)。