快速實時的PCR檢測---賽多利斯實驗室

支原體是世界上最小的能夠獨立繁殖的細菌之一。它們屬于柔膜細菌目（Mollicutes），具有非常緩慢的寄生生長方式。支原體可引起動物和植物體內(nèi)的眾多感染現(xiàn)象。

快速實時的PCR檢測

用于支原體DNA敏感檢測的實時PCR技術(shù)

本文以使用Vivaspin® 20 超濾管進行DNA分離，用Microsart® AMP進行支原體檢測為例。基于PCR的檢測試劑盒為用戶提供可靠、穩(wěn)定的檢測結(jié)果，耗時只需3小時，該方法簡易且經(jīng)濟、即取即用、靈敏度高。

支原體沒有細菌所具有的細胞壁，也就沒有抗體的攻擊點，因而非常難以控制。鑒于此，使用傳統(tǒng)的除菌過濾器（0.2μm孔徑）對支原體實現(xiàn)完全截留。不可忽視的是，支原體的細胞大小為0.5-0.8μm，同時具有極大的靈活性和變形能力，能夠通過除菌濾器。

支原體檢測

檢測支原體污染的方法有許多種。以生長法舉例，在特定液體或固體的營養(yǎng)培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，或通過熒光顯微鏡的方式進行檢測等都是非常普遍的方法。在目前的“金標準”里，生長檢測需要至少有28天的培養(yǎng)時間，然后使用這些可用排除法確定并且緩慢生長的細菌進行污染。在此階段中，樣品必須要在白天可肉眼檢測，而這也需要大量的時間。

即使采用熒光顯微鏡進行輔助檢測，依然需要至少8天的時間來排除鑒定支原體的感染。另外，操作者需要經(jīng)過專門培訓(xùn)，擁有豐富的經(jīng)驗，并知道特殊知識，才可有能力排除對結(jié)果的干擾。

“3-小時”替代法

基于PCR的檢測試劑盒（如賽多利斯公司的Microsart®  AMP支原體試劑盒）可為用戶提供靈敏、穩(wěn)定的檢測結(jié)果，耗時只需3小時。該方法簡易且經(jīng)濟、試劑盒即取即用。試劑盒上僅需要一個能夠檢測熒光染料FAM和ROX的實時PCR儀即可。該PCR試劑盒適用于各種各樣的初始樣品。配合使用Vivaspin® 20或Vivaspin® 6超濾管，則可處理高達18ml的樣品體積，從而確保高的靈敏度。
實驗部分

下面所述的是一個使用Vivaspin® 20超濾管進行DNA分離并用Microsart® AMP進行支原體檢測的案例。

將Mycoplasma fermentans于37℃在Hayflick培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，直至酚紅指示劑顏色發(fā)生輕微的改變，然后將其用1xPBS（磷酸鹽緩沖液）以1:1000的比例進行稀釋。用移液器將18ml的稀釋樣品平均加入至每個Vivaspin® 20超濾管。為了中和非特異性化合物，在每份樣品中添加2ml的包被緩沖液。然后以3500x g的轉(zhuǎn)速離心20分鐘，直至濃縮后的剩余體積約為200μl。在200μl裂解緩沖液的協(xié)助下，將全部濃縮物轉(zhuǎn)移至一支新的1.5ml反應(yīng)管中。緩沖液是用于沖洗Vivaspin® 20超濾管，以確保樣品被完全徹底地轉(zhuǎn)移。將200μl濃縮樣品和200μl裂解緩沖液組成的混合物在56℃孵育15分鐘，以促使細胞完全裂解。在該步驟之后，使用濃縮管將DNA分離。在DNA分離過程中，采用Microsart® AMP提取試劑盒，并根據(jù)試劑盒說明書進行操作。幾乎全部分離的DNA都要用于實時PCR（60μlDNA洗脫液中的50μl），以達到最大的敏感度。

平行測試中，在不經(jīng)過Vivaspin® 濃縮步驟的情況下，取相同初始量的DNA進行分離，以對經(jīng)過濃縮和未經(jīng)過濃縮的樣品進行直接對比。

根據(jù)試劑盒說明書操作，PCR反應(yīng)步驟如下：

 

l 將試劑盒中反應(yīng)管與凍干成分一起以最大速度離心5秒，將1275μl的緩沖液添加至引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）中。

 

l 將300μl水（PCR質(zhì)量級別）添加至陽性對照（綠帽）和內(nèi)參對照（黃帽）中。

 

l 在室溫下孵育5分鐘，直至完全混合。

 

l 將溶液和Vortex混合物簡單混合，并快速離心。

 

l 主混合物（Master Mix）的組成：每次均將49μl的引物/探針/核苷酸混合物（紅帽）和1μl的內(nèi)參對照（黃帽）進行反應(yīng)，移液并混合至一支1.5ml的反應(yīng)離心管中。

 

將50μl主混合物和50μl樣品或陽性對照或陰性對照液（比如：洗脫緩沖液，PCR水，或者10mM Tris緩沖液）移液至200μl的PCR管中，并插入至經(jīng)過預(yù)設(shè)程序的實施熱循環(huán)儀中。

將濃縮樣品的Ct值（循環(huán)閾值）與未濃縮樣品持續(xù)進行比較。Ct值是當熒光信號達到某個設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的擴增循環(huán)數(shù)。表1列出了每一個Ct值。表2所示的是平均ΔCt值，即表1和使用或者未使用包被緩沖液樣品之間的Ct值之差。ΔCt值的測定為：ΔCt-Ct（未經(jīng)Vivaspin濃縮的樣品）-Ct（濃縮樣品）。

 

與包被緩沖液一起進行共同濃縮后，Mycoplasma fermentans可達到ΔCt>7的Ct差值。當沒有使用包被緩沖液（個值未列出）時，記錄的ΔCt值為稍低一點的6，盡管這一結(jié)果可能是由于Vivaspin® 超濾管的離心時間更短而造成的。不過，它仍然顯示了在靈敏度上有了顯著的提高。

 

靈敏度以及時間等參數(shù)對于支原體污染的調(diào)查而言是至關(guān)重要的。在濃縮步驟中，這些參數(shù)在PCR試劑盒中都會有詳細描述。通過使用Vivaspin® 20，Ct值可提高到ΔCt>7，相應(yīng)的靈敏度可以增加大約2 log的水平。這使得Microsart® AMP檢測試劑盒和Vivaspin® 20能夠成為經(jīng)濟、有效又實用的快速支原體檢測工具

實驗結(jié)果與討論

使用TaqMan® 探針進行實時 qPCR 能夠檢測支原體的DNA，起始體積 200 μl -18 ml。通過qPCR 循環(huán)對樣本DNA進行擴增，通過軟件系統(tǒng)得到試驗結(jié)果。